Szybka i skuteczna diagnoza dostosowująca leczenie wielu chorób, w tym o podłożu nowotworowym, indywidualnie do każdego przypadku? Naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN zrobili duży krok w tym kierunku, opracowując nowe rozwiązanie w urządzeniach mikroprzepływowych.
Rak jest plagą XXI wieku i pomimo szybkiego rozwoju diagnostyki medycznej i spersonalizowanych metod leczenia większość terapii pozostaje niewystarczająca, aby uratować życie pacjenta. Terminowa i dokładna diagnoza ma ogromne znaczenie, ale gdy pacjent zostanie zdiagnozowany, wynik walki o uratowanie życia nadal zależy od wielu czynników. Chirurgia, chemioterapia, radioterapia, leczenie ciepłem, immunoterapia i różne kombinacje tych metod pomagają w wygraniu bitwy, ratując życie jednego pacjenta, ale mogą być nieskuteczne w przypadku innego. Naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN, we współpracy z kilkoma zespołami z innych ośrodków, opracowali nowe rozwiązanie w urządzeniach mikroprzepływowych, które przybliża nas do szybkiej i skutecznej diagnozy, w zależności od której terapia może być dostosowana indywidualnie do każdego przypadku.
Techniki mikroprzepływowe są wnikliwie badane od kilku dekad. Manipulacja płynami w maleńkich kanałach znalazła już zastosowanie w chemii analitycznej, biologii syntetycznej, materiałoznawstwie, optyce, a nawet w technologii informacyjnej. Najbardziej znaczące i rewolucyjne zastosowania mikrofluidyka znalazła jednak w mikrobiologii i diagnostyce medycznej, gdzie jej działanie w zakresie od nanometrów do mikrometrów doskonale nadaje się do badań pojedynczych komórek. Zdolność do skanowania setek tysięcy pojedynczych komórek w ciągu jednej sekundy zrewolucjonizowało sposób, w jaki można badać poszczególne komórki, a nawet ich indywidualne i zbiorowe zachowania oraz reakcję na leki lub zmiany warunków środowiskowych. Ilość informacji, jaką można uzyskać przy stosowaniu mikrofluidyki, w połączeniu z szybkością, dokładnością i specyficznością tej technologii może stać się potężnym narzędziem w diagnozowaniu śmiertelnych chorób, takich jak nowotwory. Motywacją zespołu badawczego do zbudowania innowacyjnego urządzenia diagnostycznego opartego na mikroprzepływach była możliwość wczesnego diagnozowania raka krwi, czyli białaczki.
Zrealizowaliśmy ten projekt w konsorcjum z sześcioma najlepszymi polskimi grupami badawczymi z różnych dziedzin. Jako zespół mikroprzepływowy opracowywaliśmy serce urządzenia diagnostycznego: mikroprzepływowy chip, który obsługuje komórki krwi, dostarcza je pojedynczo do maleńkiego punktu detekcji spektrometru z wyjątkową dokładnością, zatrzymuje komórki do detekcji i wreszcie, w oparciu o wykryte sygnały, sortuje komórki, izoluje potencjalnie interesujące komórki do dalszych badań – wyjaśnia dr Ladislav Derzsi z IChF PAN.
Oprócz tego zespół z Uniwersytetu Warszawskiego buduje główny szkielet systemu diagnostycznego – mikroskop ramanowski. Inny zespół z Instytutu Chemii Fizycznej buduje jedyny w swoim rodzaju laser pompujący. Na Uniwersytecie Jagiellońskim odpowiadają za detekcję i analizę widm ramanowskich. Wreszcie, dwa zespoły, jeden na Uniwersytecie Medycznym w Łodzi, a drugi w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii Krwi w Warszawie, zajmują się częścią mikrobiologiczną.
Celem prac było zintegrowanie mikroprzepływów z potężną nową techniką zwaną stymulowaną spektroskopią Ramana (SRS). Stawia ona ten system diagnostyczny na zupełnie nowym poziomie.
Dla lekarzy SRS może być techniką podobną do pobierania odcisku palca dla detektywów i kryminalistyki. Wykrywa wibracje wiązań molekularnych, które są tak unikalne dla cząsteczek, jak odcisk palca dla ludzi. Komórki nowotworowe, pomimo ich dużej różnorodności i heterogeniczności, mają wspólną cechę polegającą na tym, że różnią się pod względem aktywności metabolicznej i metabolitów od zdrowych komórek. Zbudowanie biblioteki powiązanych widm Ramana pozwoliłoby na zautomatyzowaną identyfikację komórek nowotworowych na podstawie ich markerów Ramana. W konsekwencji wykorzystanie SRS w diagnostyce może nie tylko ujawnić obecność rozwijającego się nowotworu, ale może również dostarczyć informacji o jego typie, podtypie, stadium rozwoju i wszystkich niezbędnych informacji do zaplanowania leczenia dostosowanego do danego pacjenta – tłumaczy Shreyas Vasantham, pierwszy autor publikacji.
Aby z powodzeniem zastosować taką ultra-specyficzną diagnostykę, należy jednak pokonać kilka wyzwań technicznych. Przede wszystkim komórki muszą być przechwytywane jedna po drugiej i utrzymywane w bezruchu na czas skanowania… ale bez ich dotykania. Nieinwazyjne techniki manipulacji – lub, jak określają je specjaliści, „chwytanie bez dotykania” – są stosowane przy użyciu dielektroforezy, ultradźwięków lub światła laserowego. Wśród nich najmniej oczywistą, ale prawdopodobnie najpotężniejszą metodą chwytania cząstek i komórek jest światło. Odkrycie możliwości chwytania i przesuwania mikroskopijnych obiektów wyłącznie za pomocą światła oraz opracowanie działającej techniki, która stała się znana jako „pęseta optyczna”, przyniosło jej wynalazcy, Arthurowi Ashkinowi, Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w 2018 roku.
Od czasu pierwszego doniesienia o tej metodzie w 1986 roku pęseta optyczna przeszła długą drogę. Postęp technologiczny w dziedzinie światłowodów umożliwił naukowcom zastąpienie tradycyjnych metod opartych na obiektywach mikroskopów, które są nieporęczne i drogie, światłowodami nieco grubszymi niż ludzki włos, które mieszczą się w dłoni, nawet w połączeniu z laserem diodowym i całą elektroniką urządzenia.
Aby uzyskać skuteczną pęsetę optyczną, światło lasera musi być skupione (i właśnie dlatego zastosowano obiektywy mikroskopowe), ale laser emitowany z końcówki światłowodu jest zwykle rozbieżny i raczej odpycha cząsteczki niż je przyciąga. Aby temu zaradzić, dostępne podejścia oparte na światłowodach wykorzystują jedną z dwóch metod. Po pierwsze, rozmieszczenie dwóch światłowodów naprzeciwko siebie i popychanie komórek z dwóch przeciwnych stron, utrzymując je w punkcie środkowym, w którym dwie przeciwstawne siły znoszą się nawzajem. Po drugie, przy użyciu tylko jednego światłowodu, którego końcówka jest chemicznie wytrawiona, nanodrukowana lub zmodyfikowana w celu uzyskania skupienia wiązki laserowej. Stosowanie dwóch światłowodów wymaga bardzo precyzyjnego wyrównania przeciwbieżnych wiązek światła, a zaawansowana modyfikacja końcówki światłowodu i ograniczenia rozmiaru cząstek sprawiają, że podejście bazujące na zastosowaniu tylko jednego światłowodu jest mniej atrakcyjne.
Zespół mikroprzepływowy zademonstrował nowatorskie, proste, ale eleganckie podejście: używając pojedynczego światłowodu bez żadnych modyfikacji jego końcówki, z wyjątkiem prostego cięcia. Badacze zintegrowali światłowód bezpośrednio z kanałem mikroprzepływowym, którego końcówka jest skierowana w kierunku przeciwnym do przepływu. W tej konfiguracji opór hydrodynamiczny w kanale mikroprzepływowym przenosi/spycha komórki prosto w kierunku końcówki światłowodu, a wiązka laserowa rozchodząca się ze światłowodu odpycha komórki. W przypadku, gdy te dwie przeciwnie rozchodzące się siły są równej wielkości, wypadkowa siła działająca na komórkę wynosi zero i a komórka zostaje uwięziona. Co więcej, komórki w mikrokanale są osłonięte ze wszystkich czterech stron cieczą buforową, co pozwala badaczom skupić komórki w bardzo wąskim strumieniu. Gdy natężenia przepływu wszystkich czterech cieczy są takie same, komórki są wypychane z każdej strony symetrycznie, a wąska para przepływa przez środek kanału. Jednak niewielka zmiana szybkości przepływu cieczy pozwala nam precyzyjnie dostroić, tj. dynamicznie wyrównać pozycję strumienia komórek z wiązką lasera (w przypadku, gdy światłowód jest poza osią), maksymalizując w ten sposób wydajność wychwytywania.
Nasze pęsety optohydrodynamiczne (OHT) oferują ulepszoną alternatywę dla konwencjonalnych pęset światłowodowych do szerokiego zakresu zastosowań w fizyce, biologii, medycynie itp. Regulując moc optyczną i natężenie przepływu, byliśmy w stanie uwięzić pojedyncze cząstki w pożądanych pozycjach w kanale z bardzo wysoką precyzją, a także manipulować nimi na długim dystansie w górę lub w dół z maksymalną odległością 500 μm – mówi Shreyas Vasantham.
Co więcej, OHT pozwala na znacznie wyższe prędkości przepływu do 4300 μm/s w porównaniu z tradycyjnymi pęsetami światłowodowymi, ponieważ siła oporu jest równoważona przez rozpraszanie optyczne, a nie siłę gradientu. Ponadto manipulacja i przemieszczanie uwięzionych cząstek na duże odległości do 500 μm jest możliwe w ramach kontrolowania mocy optycznej i szybkości przepływu w kanałach. Kolejną zaletą OHT jest znacznie niższa intensywność promieniowania optycznego na manipulowanej cząsteczce, co ogranicza jej uszkodzenia podczas pracy.
W zależności od zastosowania, cząstki mogą być albo uwięzione i uwalniane w sposób ciągły w celu zebrania informacji o próbce w sposób wysokowydajny, albo pojedyncza cząstka może być analizowana przez długi czas poprzez zatrzymanie przepływu próbki przy jednoczesnym utrzymaniu wszystkich przepływów cieczy. Zauważyliśmy, że stężenie cząstek można regulować w celu utrzymania określonej średniej częstotliwości napływających cząstek w pułapce, tak aby cząstka mogła zostać uwolniona po zebraniu wymaganych informacji przed nadejściem kolejnej – dodaje Vasantham.
System OHT oferuje jeszcze dodatkową funkcję: jego zdolność do sortowania komórek po wykryciu i izolowania potencjalnie interesujących mutacji pozwala na testowanie skuteczności proponowanych leków i terapii bez narażania pacjenta na działanie leków.
OHT ma jeszcze jeden atut w porównaniu z konwencjonalnymi pęsetami światłowodowymi: użycie pojedynczego światłowodu w porównaniu z dwoma stosowanymi w pęsetach światłowodowych o podwójnej wiązce minimalizuje ogólną intensywność promieniowania optycznego na cząstce, ograniczając w ten sposób uszkodzenia uwięzionej cząstki – wskazuje dr Yurii Promovych, jeden ze współautorów badań.
Proponowana konfiguracja OHT jest obiecującym narzędziem do zastosowania w medycynie spersonalizowanej, które toruje drogę do szybkiej diagnostyki przy użyciu urządzeń typu lab-on-a-chip i rzuca nowe światło na dostarczanie spersonalizowanych terapii, w tym terapii przeciwnowotworowych.
Wyniki badań, finansowanych przez Fundację na rzecz Nauki Polskiej, zostały opublikowane w czasopiśmie Lab on a Chip.
Magdalena Osial, źródło: IChF PAN