Innowacyjne urządzenie do monitorowania poziomu białka C-reaktywnego, które jest wytwarzane w organizmie podczas stanu zapalnego, opracowali naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN. Rozwiązanie umożliwia prowadzenie analiz w czasie rzeczywistym, znacząco skracając czas i koszty badań.
Białko C-reaktywne (CRP) to cząsteczka będąca ważnym czynnikiem zaostrzającym wiele chorób o różnej etiologii. Chociaż jest znane i stosowane do rozpoznania stanu zapalnego od wielu dekad, to wykorzystanie go jako potencjalnego biomarkera w diagnostyce innych stanów chorobowych w organizmie jest stosunkowo nowe. CRP to białko osocza wytwarzane w wątrobie i uwalniane do krwiobiegu w odpowiedzi układu odpornościowego. Działa tym samym jako biomarker stanu zapalnego oraz infekcji.
Monitorowanie poziomu CRP pomaga zdiagnozować nawet ciężkie stany, takie jak posocznica, martwica niedokrwienna, a nawet nowotwory złośliwe. Ponieważ białko to jest klasyfikowane jako czynnik tzw. ostrej fazy, pojedynczy pomiar poziomu CRP wskazuje jedynie na choroby zapalne, a badania krwi muszą być często powtarzane w celu określenia skuteczności określonej terapii. Obecnie, pomimo postępu technologicznego w biomedycynie i diagnostyce medycznej, techniki stosowane do monitorowania poziomu CRP są nadal dalekie od pomiarów prowadzonych w czasie rzeczywistym.
Wychodząc naprzeciw temu w2yzwaniu, naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN, kierowani przez prof. Martina Jönssona-Niedziółkę, zaprezentowali nowatorskie narzędzie diagnostyczne do precyzyjnego pomiaru poziomu CRP. Umożliwia ono prowadzenie analiz w czasie rzeczywistym, znacząco skracając czas i koszty badań. Proponowane rozwiązanie opiera się na podłączonym do smartfona urządzeniu, dzięki czemu pomiar można wykonać w dowolnym miejscu, np. bezpośrednio przy pacjencie (point-of-care testing, POCT). Samo urządzenie jest wielkości karty kredytowej, wyposażone w biosensory elektrochemiczne połączone z technologią komunikacji bliskiego zasięgu, a wszystko to zostało umieszczone w niewielkim urządzeniu mikroprzepływowym.
W przeciwieństwie do już opracowanych biosensorów, które wykorzystują duże przeciwciała IgG do wychwytywania istotnych biomarkerów stanu zapalnego, opracowane przez badaczy z IChF PAN urządzenie POCT oferuje wyższą czułość i stabilność, a przede wszystkim pomiary w czasie rzeczywistym, znacznie zwiększając potencjalne zastosowanie w diagnostyce CRP. Urządzenie wyposażone w biosensor może wychwytywać i oznaczać ilościowo CRP ze skutecznością podobną do klasycznych i kosztownych testów, np. ELISA. Pomiary są wykonywane elektrochemicznie przy użyciu dostępnego na rynku, przenośnego potencjostatu, podczas gdy wychwytywanie CRP odbywa się na unikalnej elektrodzie wbudowanej w wąskie kanały urządzenia mikroprzepływowego. System wykorzystuje również technologię komunikacji bliskiego zasięgu (near-field communication, NFC), która pozwala na bezprzewodową wymianę danych między elektrodami a urządzeniami mobilnymi. Wyniki pomiaru mogą być wyświetlane na smartfonach z systemem Android, zapewniając użytkownikom skuteczny sposób gromadzenia i analizowania wyników zmierzonych elektrochemicznie w czasie rzeczywistym.
Jak to działa? Próbka płynu jest umieszczana na małej płytce urządzenia mikroprzepływowego wyposażoną w małą elektrodę. Poprzez drobne kanaliki w urządzeniu, próbka podawana jest stopniowo do kolejnych części urządzenia wraz z dodatkowym roztworem zaledwie za pomocą sił kapilarnych bez konieczności stosowania zewnętrznej pompy, co umożliwia automatyczny przepływ sekwencyjny. Kluczową rolę w zaprezentowanym urządzeniu odgrywają nanociała anty-CRP unieruchomione na elektrodzie. Nanociała to małe fragmenty przeciwciał, które stanowią alternatywę dla konwencjonalnych przeciwciał stosowanych do ilościowego oznaczania CRP. Ze względu na niewielki rozmiar, większą odporność na degradację w porównaniu z przeciwciałami, nanociała uzyskane metodą tzw. phage display mogą być stosowane w różnych warunkach eksperymentalnych, osiągając wysoką specyficzność wiązania antygenu.
Aby unieruchomić nanociała anty-CRP na elektrodzie, zmodyfikowano hydroksylowe grupy funkcyjne obecne na utlenionej elektrodzie w celu otrzymania grup aldehydowych w reakcji utleniania. Następnie, nanociała te zostały unieruchomione na utlenionej elektrodzie za pomocą wiązania iminowego (C═N). W ten sposób uzyskaliśmy elektrodę o wysokim specyficznym powinowactwie do antygenu – relacjonuje dr Suchanat Boonkaew z IChF PAN.
Wysoki stopień pokrycia elektrody nanociałami ze względu na ich niewielki rozmiar poprawia czułość pomiaru elektrochemicznego nawet w zakresie bardzo niskich stężeń. Zapewnia to balans pomiędzy dokładnością analityczną w fizjologicznie istotnym zakresie stężeń a czasem analizy.
Aby wyprodukować elektrodę modyfikowaną nanociałami, oparliśmy się na naszym doświadczeniu w tzw. biopanningu w celu odzyskania nowych nanociał specyficznych dla CRP, które zostaną wykorzystane jako materiał aktywny w wytworzonym przez nas biosensorze – mówi dr Katarzyna Szot-Karpińska z IChF PAN.
Selektywność proponowanego biosensora opartego na nanociałach została przetestowana w różnych mediach, zakłócając pomiary obecnością związków biologicznie czynnych, takich jak interleukina-6, fibrynogen, mioglobina, albumina surowicy bydlęcej i albumina surowicy ludzkiej, a także eksponując urządzenie na różne warunki eksperymentalne, w tym zmiany temperatury i wilgotności.
Zaproponowana metoda została zastosowana do wykrywania CRP w pełnej krwi ludzkiej uzyskanej od anonimowych dawców. Wyniki eksperymentów wykazały, że system oparty na NFC zintegrowany z przepływowym urządzeniem mikroprzepływowym może prawidłowo oznaczać CRP w istotnych klinicznie próbkach biologicznych bez konieczności stosowania dodatkowych procedur wstępnych, a zatem może być stosowany do oceny stanu zapalnego, infekcji wywołanych przez bakterie lub wirusy oraz monitorowania zwiększonego ryzyka chorób serca – wyjaśnia prof. Martin Jönsson-Niedziółka.
Niezależnie od etiologii stanu zapalnego, szybka i selektywna diagnostyka umożliwiająca monitorowanie skuteczności leczenia w czasie rzeczywistym jest wciąż daleka od ideału. Dlatego możliwość wykorzystania szybkich i przenośnych urządzeń do badania w punktach opieki bez wątpienia zrewolucjonizowałaby wiele sektorów diagnostyki medycznej, ułatwiając życie wielu pacjentom. Urządzenie zademonstrowane przez naukowców z IChF PAN to niezawodne i ekonomiczne rozwiązanie diagnostyczne oferujące przyjazną dla użytkownika obsługę i szybkie uzyskanie wyników w ciągu zaledwie kilku minut bez wychodzenia z domu. Zapewnia ono również powtarzalność zarówno w produkcji biosensorów, jak i wykrywaniu CRP. To krok w kierunku nowoczesnej i spersonalizowanej opieki zdrowotnej. Elektrody oparte o nanociała umożliwiają przeprowadzanie wielu analiz w czasie rzeczywistym, przyspieszając diagnostykę i ocenę skuteczności leczenia, dzięki czemu możliwe jest natychmiastowe podejmowanie decyzji co do leczenia pacjenta i szybkie poprawienie rezultatów terapii.
Wyniki badań przeprowadzonych w Instytucie Chemii Fizycznej PAN opublikowało czasopismo ACS Sensors.
Magdalena Osial, źródło: IChF PAN