Opracowane w Instytucie Chemii Fizycznej PAN nowe techniki analizy płynu mózgowo-rdzeniowego pozwalają w niecały kwadrans zdiagnozować, czy chorobę wywołały bakterie. Do identyfikacji wystarczy zaledwie jedna komórka bakterii.
Za wywołanie zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych mogą odpowiadać różne czynniki. Im szybciej więc lekarze będą wiedzieć co wywołało chorobę, tym wcześniej będą mogli dopasować właściwą terapię i zapobiec eskalacji schorzenia, które nierzadko prowadzi do śpiączki lub śmierci pacjenta. Dotychczasowe metody analizy wymagały prób namnażania bakterii, co trwało nawet kilkadziesiąt godzin. Nowa metoda może to radykalnie zmienić, ponieważ jest szybka, a czas to istotny element w przypadku zakażeń bakteryjnych.
– Opracowaliśmy nowatorskie podłoża, bazujące m.in. na matach polimerowych pokrytych złotem bądź srebrem, które posłużyły nam jednocześnie do filtracji bakterii ze złożonych układów biologicznych, czyli z moczu czy płynu mózgowo-rdzeniowego i mobilizacji nawet pojedynczych mikroorganizmów w określonym miejscu podłoża – mówi dr Agnieszka Kamińska z Instytutu Chemii Fizycznej PAN.
Do przeprowadzenia pomiaru potrzebna jest próbka płynu o objętości zaledwie mikrolitra, w której wystarczy znaleźć jedną bakterię, żeby zidentyfikować gatunek odpowiedzialny za rozwój choroby. W tym nowatorskim rozwiązaniu wykorzystano niezwykle czułą technikę analizy – wzmacnianą powierzchniowo spektroskopię ramanowską (SERS, czyli Surface-Enhanced Raman Spectroscopy).
IChF PAN we współpracy z Instytutem Fizyki PAN w Warszawie opracował specjalne podłoża z tlenku cynku. Wykorzystano je do pomiarów metodą SERS stężeń pewnego związku – neopteryny w próbkach płynu mózgowordzeniowego. Próbki, które udostępnił Narodowy Instytut Leków (NIL) w Warszawie, pochodziły od pacjentów z wcześniej zdiagnozowanym zapaleniem opon mózgowych. Okazało się, że w płynie mózgowym takich osób stężenie neopteryny było dziesięciokrotnie wyższe niż w próbce referencyjnej, pobranej od zdrowej osoby.
– Podwyższone stężenie neopteryny to cenna informacja, że organizm walczy z chorobą o podłożu bakteryjnym. Jednak zapalenie opon mózgowych może być efektem zakażenia różnymi gatunkami bakterii. Żeby działać naprawdę efektywnie, lekarz powinien wiedzieć, z którym gatunkiem ma właśnie do czynienia – podkreśla dr hab. Anna Skoczyńska, prof. NIL.
Pomiary widm ramanowskich bakterii w płynie mózgowo-rdzeniowym okazały się trudne, ponieważ w przeciwieństwie do cząsteczek chemicznych, które nie przemieszczają się po podłożu, bakterie znajdują się w ciągłym ruchu. Przed naukowcami pojawiło się wyzwanie – należało opracować podłoża, które nie tylko zapewnią wzmocnienie sygnału ramanowskiego, ale także odfiltrują bakterie z płynu oraz skutecznie je unieruchomią na czas pomiaru.
Rozwiązaniem okazały się tanie, komercyjnie dostępne maty tkane, pokrywane w IChF PAN cienką (grubość to ok. 70-80 nanometrów) warstwą stopu złota i srebra. Przez układ kilku takich mat, o malejących porach, przepuszczano strumień płynu mózgowo-rdzeniowego podawany przez pompę strzykawkową. Gdy bakteria docierała do maty o zbyt małych oczkach, grzęzła w jednym z nich, a odpowiednio dobrana prędkość przepływu strumienia płynu uniemożliwiała jej zmianę położenia.
– Przetestowaliśmy nasze podłoża na trzech gatunkach bakterii wywołujących zapalenie opon mózgowych: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae. Poprawnie wykrywaliśmy ich obecność w 95% przypadków, a gatunek identyfikowaliśmy z pewnością sięgającą 98%. A ponieważ mówimy o niezwykle czułej spektroskopii ramanowskiej, do otrzymania tak precyzyjnych wyników wystarczało nam znalezienie jednej komórki bakteryjnej – podkreśla dr Kamińska.
Cały przebieg analizy jest w znacznym stopniu zautomatyzowany i do minimum ogranicza kontakt laboranta z badaną próbką. W celu przeprowadzenia pomiaru należy jedynie pobrać pod wyciągiem laminarnym mikrolitrową porcję płynu mózgowo-rdzeniowego do strzykawki, a następnie umieścić ją w pompie strzykawkowej podłączonej do spektrometru Ramana. W celu zwiększenia pewności pomiaru zarejestrowane sygnały są przetwarzane przez oprogramowanie korzystające z zaawansowanych metod statystycznych i obsługującemu pozostaje jedynie odczytać wynik.
W stosunku do dotychczasowych metod rozwiązanie opracowane przez IChF PAN ma szereg zalet. Potrzeba niewielkich ilości płynu mózgowo-rdzeniowego, automatyzacja pomiaru gwarantuje wysoki poziom bezpieczeństwa, a wynik jest po kilku minutach. Istotnym czynnikiem jest także cena sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia analizy nie przekracza kilkudziesięciu tysięcy dolarów, leży więc w zasięgu możliwości finansowych nawet małych placówek medycznych
Jk
(źródło: Rynek Zdrowia)