Naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN za pomocą jednej z superrozdzielczych technik mikroskopowych są w stanie śledzić reakcje chemiczne przebiegające w bardzo małych objętościach. Opracowana przez polskich fizyków metoda analizy jako pierwsza daje potencjalną możliwość obserwowania reakcji zachodzących nie tylko wewnątrz żywych komórek, ale nawet w ich poszczególnych organellach, takich jak jądra komórkowe.
Wprawdzie dzięki rozwojowi techniki dysponujemy coraz doskonalszymi narzędziami pozwalającymi bezpośrednio przyglądać się zjawiskom chemicznym zachodzącym w żywych komórkach, ale nie wiemy, jaka część substancji chemicznych zaangażowanych w daną reakcję występuje w komórce w formie przereagowanej, a jaka w nieprzereagowanej. Dotychczasowe przeciwności pokonała grupa naukowców z IChF PAN w Warszawie we współpracy z berlińską firmą PicoQuant GmbH. Opracowali modyfikację jednej z najnowocześniejszych technik mikroskopowych: superrozdzielczej spektroskopii korelacji fluorescencji.
– Reakcje biologiczne są na ogół odwracalne i tam, gdzie zachodzą, zwykle wytwarza się pewna dynamiczna równowaga między ilością substancji przereagowanych a związkami nieprzereagowanymi. Próbując wyznaczyć stałe równowagi dla różnych reakcji w komórkach sięgnęliśmy po superrozdzielczą spektroskopię korelacji fluorescencji. I tu natknęliśmy się na ciekawy problem techniczny, którego rozwiązanie otworzyło nam nowe możliwości w badaniu chemii życia – mówi prof. dr hab. Robert Hołyst z IChF PAN.
Istnieje wiele odmian mikroskopii, w tym o rozdzielczościach, które pozwalają na dostrzeżenie pojedynczych atomów. Jednak przy obserwowaniu komórek bezkonkurencyjna pozostaje mikroskopia optyczna, tyle że jej podstawową wadą była przez długi czas słaba rozdzielczość.
Jedną z odmian mikroskopii optycznej jest mikroskopia fluorescencyjna. Polega ona na wprowadzeniu barwnika fluorescencyjnego w badane miejsca próbki biologicznej, a następnie skanowaniu próbki zogniskowaną wiązką lasera. Cząsteczki barwnika znajdujące się w ognisku zostają pobudzone do świecenia. Przepuszczając wyemitowane przez nie światło przez specjalny otwór konfokalny można otrzymać obrazy o podwyższonej rozdzielczości. W 1994 roku Stefan W. Hell zaprezentował sposób przekroczenia limitu dyfrakcyjnego w mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą wygaszania emisją wymuszoną (STimulated Emission Depletion, STED). Stosunkowo młodą gałęzią mikroskopii optycznej jest mikroskopia konfokalna z korelacją fluorescencji (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS). W odmianach superrozdzielczych ognisko lasera ma tu objętość liczoną w dziesiątkach attolitrów (jeden attolitr to miliardowa część jednej miliardowej litra). Pomiar polega na mierzeniu światła emitowanego przez barwnik fluorescencyjny doczepiony do badanej cząsteczki, wzbudzony przez wiązkę laserową. Znając rozmiary ogniska i czas trwania fluorescencji oraz wspomagając się odpowiednimi modelami teoretycznymi, można dość precyzyjnie ustalić prędkość ruchu nawet pojedynczych cząsteczek.
– Od pewnego czasu było wiadomo, że o ile superrozdzielcza mikroskopia FCS sprawdza się przy obserwowaniu cząsteczek poruszających się w dwóch wymiarach, o tyle zawodzi przy obserwacjach w pewnej objętości. Czasy dyfuzji, wyznaczane na podstawie pomiarów w 3D, potrafiły się różnić od przewidywań z pomiarów w 2D o rząd wielkości, a nawet więcej. Po kilku miesiącach badań stało się dla nas jasne, że za te rozbieżności odpowiada zbyt uproszczony sposób wyznaczania przestrzennych rozmiarów ogniska – mówi dr Krzysztof Sozański z IChF PAN.
Na podstawie własnych analiz teoretycznych oraz doświadczeń warszawscy naukowcy, finansowani z grantów MAESTRO NCN i ERA Chairs europejskiego programu Horizon 2020, skonstruowali nowy, uniwersalny model teoretyczny wprowadzający korektę przestrzennego kształtu ogniska i uwzględniający jej wpływ na zmierzony stosunek sygnału do szumu. Poprawność modelu początkowo zweryfikowano w pomiarach szybkości dyfuzji różnych fluoryzujących próbników w roztworach, a potem w bardziej zaawansowanych eksperymentach.
– Badaliśmy na przykład odwracalną reakcję, w której cząsteczki barwnika przyczepiały się do micel, a po pewnym czasie się odczepiały. Układ zbudowany ze stosunkowo dużych kulek z cząsteczek surfaktantów reagujących z cząsteczkami barwnika odwzorowywał warunki charakterystyczne dla obiektów biologicznych – mówi doktorant Xuzhu Zhang z IChF PAN.
Ważną cechą metody analitycznej opracowanej w IChF PAN jest fakt, że do jej stosowania nie są potrzebne zmiany w aparaturze. Po odpowiedniej adaptacji metoda może być użyta w celu dokładniejszego interpretowania danych zarejestrowanych przez już wyprodukowane mikroskopy korzystające z techniki STED.
JK
(Źródło: IChF PAN)