Oprócz odkrywania nowych i skutecznych metod dostarczania określonych związków do komórki, naukowcy poszukują również metod kwantyfikacji tego procesu, tj. wyznaczania parametrów, takich jak liczba cząsteczek wchodzących do komórki i czas ich wejścia. Nowatorskie podejście w tym zakresie zaprezentowali ostatnio badacze z Instytutu Chemii Fizycznej PAN.
Każda komórka naszego ciała jest wyposażona w naturalną barierę przed środowiskiem zewnętrznym zwaną błoną komórkową. Bariera ta może jednak zostać z łatwością pokonana przez substancje chemiczne niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania komórki. Przemieszczanie się substancji przez błonę do wnętrza lub na zewnątrz komórki nazywane jest transportem komórkowym, które choć bardzo wydajne, czasami wymaga dodatkowego czynnika, takiego jak obecność białka. Pełni ono funkcję receptora dla określonej substancji chemicznej służącej niemal jak „imienny bilet wstępu” na „spektakl” zwany endocytozą. Proces ten jest na tyle selektywny, że makrocząsteczki mogą dostać się do komórek tylko i wyłącznie przez wychwycenie i zamknięcie w nośnikach związanych z błoną.
Komórki wykorzystują wiele różnych mechanizmów endocytozy, a w jednej z nich pośredniczy klatryna. Najpierw receptory na powierzchni komórki selektywnie wiążą makrocząsteczki, które koncentrują się w określonych wgłębieniach na powierzchni komórki. Następnie ściskają się, tworząc pęcherzyki pokryte klatryną, które przenoszą ładunek do wnętrza komórki. W ten sposób odbywa się pobieranie składników odżywczych, a także sygnalizacja komórkowa. Jak to właściwie działa?
W ludzkich komórkach pojedyncze białko może występować w ilościach począwszy od kilku do nawet kilkudziesięciu milionów kopii na jedną komórkę. To sprawia, że obserwacja mechanizmów, w których uczestniczy kilka białek jest niebywale trudna, ponieważ potrzebne są metody pomiarowe na tyle czułe, aby móc wykrywać pojedyncze cząsteczki. Standardową metodą obserwacji molekuł wewnątrz komórki jest obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Choć metoda ta jest szeroko stosowana w wielu dziedzinach i niezwykle pomocna, pozwala jedynie na obserwacje w układzie binarnym – czy coś znajduje się wewnątrz komórki, czy nie, i to dopiero po przekroczeniu pewnego limitu cząsteczek, bez pomiaru ich liczby.
Naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN, pod kierunkiem prof. Roberta Hołysta, opracowali metodę, która rozwiązuje te ograniczenia. Badacze wykorzystują detekcję molekuł opartą na zliczaniu pojedynczych fotonów – stanowiących podstawową jednostkę, z której zbudowane jest światło. Dzięki tak czułej detekcji można zobaczyć pojedyncze cząsteczki i je zliczyć. Naukowcy skalibrowali urządzenie badawcze tak, aby przygotować pomiary jasności cząsteczek i wyeliminować sygnał tła, a następnie na podstawie pomiaru określają, ile fotonów emituje pojedyncza cząsteczka.
Do sprawdzenia swojej metody użyli transferynę będącą glikoproteiną, która odwracalnie wiąże żelazo i jest odpowiedzialna za jego transport w organizmie człowieka. Ze względu na rolę ładunku w dostarczaniu żelaza, transferyna była szeroko badana różnymi metodami, a zatem wyniki uzyskane za pomocą przedstawionej metodologii można z łatwością porównać z istniejącymi danymi literaturowymi. Wcześniej wspomniana endocytoza jest wieloetapowym procesem angażującym dziesiątki różnych białek, które współpracują ze sobą w wysoce skoordynowany sposób, aby napędzać tworzenie pęcherzyków endocytarnych. Biorąc pod uwagę złożoność tego procesu, można zapytać, jak długo on trwa? Czy proces ten zajmuje sekundy czy może minuty? I czy w ogóle liczenie czasu przebiegu tego procesu ma znaczenie? Endocytoza, oprócz zapewniania komórkom mechanizmu pobierania składników odżywczych, jest główną drogą wnikania dla wielu leków. Dlatego jej zrozumienie poprzez określenie m.in. rozdzielczości czasowej procesu może przynieść korzyści w opracowywaniu różnych strategii terapeutycznych.
Nasze badanie wykazały, że ilościowa analiza obrazów fluorescencyjnych z czułością pojedynczej cząsteczki jest niebywale prostym i jednocześnie skutecznym narzędziem idealnie nadającym się do badania endocytozy cząsteczek fluorescencyjnych. Spodziewamy się zatem, że obrazowanie ilościowe odegra ważną rolę w ocenie efektywności dostarczania leków – tłumaczy dr Marta Pilz z IChF PAN.
Do analizy obrazów fluorescencyjnych z możliwością zliczania nawet pojedynczych fotonów emitowanych przez poszczególne cząsteczki naukowcy stworzyli unikalne oprogramowanie. Dzięki innowacyjnemu połączeniu systemu detekcji i oprogramowania, możliwe było zmierzenie nawet 100 razy niższego stężenia na zewnątrz komórki niż wcześniej stosowane metody. W ten sposób można łatwo stwierdzić, jak szybko transferyna gromadzi się w komórce i czy zależy to od stężenia na zewnątrz.
Czas cyklu transferyny określający czas od wejścia tego związku do komórki do czasu jej opuszczenia został określony przez pomiar zmian stężenia transferyny w komórce w czasie. Co ciekawe, naukowcy zaobserwowali, że czas cyklu nie zależał od stężenia transferyny na zewnątrz komórki. Natomiast stężenie wewnątrz komórek było zależne od stężenia związku w pożywce stosowanej do hodowli komórkowej. Po przekroczeniu określonego stężenia zewnętrznego, wartość wewnątrz jednak nie wzrasta. Dzieje się tak, ponieważ transferyna potrzebuje wcześniej wspomnianego „biletu”, czyli unikalnego receptora wejściowego, którego liczba jest ograniczona na powierzchni komórki.
Badania naukowców z IChF PAN pokazują, że ilość receptorów transferyny można łatwo określić. Co więcej, na podstawie zależności stężenia tej molekuły wewnątrz i na zewnątrz komórek, badacze opracowali wzór matematyczny, który rozwiązywał czasy poszczególnych etapów procesu endocytozy. Badanie wykazało, że ilość czasu, jaką transferyna spędza poza komórką zależy od czasu poszukiwania wolnego receptora na powierzchni oraz od czasu internalizacji i zewnętrznego stężenia transferyny. Przy wystarczająco wysokim stężeniu tej glikoproteiny większość receptorów powierzchniowych jest zajęta, więc transferyna musi czekać na wolny receptor, który powraca z powrotem na powierzchnię komórki dopiero po zakończeniu cyklu.
Dlaczego metoda zaproponowana przez naukowców z IChF PAN jest ważna? Umożliwia potencjalne zastosowanie do innych równie złożonych zagadnień w dziedzinie biologii, np. do badania transportu cząsteczek o właściwościach terapeutycznych, w tym leków. Metodologia ta otwiera przede wszystkim możliwość ilościowej oceny efektywności dostarczania dowolnych cząsteczek fluorescencyjnych do żywych komórek. Oznacza to, że możemy stwierdzić nie tylko, czy coś jest obecne w komórkach, ale także jak szybko wchodzi i wychodzi z nich oraz w jakiej ilości.
Przedstawione wyniki pokazują, że zaproponowane rozwiązanie umożliwia ilościową ocenę endocytozy w żywych komórkach. Dzięki ilościowemu obrazowaniu fluorescencyjnemu i uzyskanej macierzy liczb fotonów można określić stężenia w dowolnym obszarze zainteresowania. Co za tym idzie, podejście to umożliwia równoległe pomiary stężeń wewnątrz i na zewnątrz komórki, a także śledzenie ich zmian w czasie, co zilustrowano tutaj badaniem kinetyki wychwytu transferyny w celu wyodrębnienia czasu cyklu transferyny – zauważa dr Marta Pilz.
Zaproponowana metoda wykazuje o wiele niższe limity detekcji w porównaniu z istniejącymi metodami. Ponadto, procedura jest bezpieczna dla komórek, eliminacja tła jest łatwo osiągalna, a pomiary mogą być z powodzeniem wykonywane w czasie rzeczywistym.
Magdalena Osial, źródło: IChF PAN