Pobudka! Wracamy do rzeczywistości, mam nadzieję, że podróż w nanoświecie nieco przybliżyła wam metodę elektroforezy kapilarnej. Podobną drogę pokonały barwniki wchodzące w skład materiałów kryjących analizowanych testamentów.

Pazerność nie popłaca

Małgorzata Szafarska

Sala sądowa, atmosfera przesycona jadem nienawiści i wzajemnych pretensji. Dwoje, jeszcze nie tak dawno bliskich sobie ludzi patrzy na siebie wilkiem. Przyczyna? Odwieczna, znana nam wszystkim, od zarania dziejów pchająca ludzi do zbrodni. Tak, żądza posiadania, niepohamowane, przysłaniające wszelkie pozytywne uczucia pragnienie przejęcia spadku po majętnej babce. Znajoma sceneria? Może nie z autopsji, jestem jednak pewna, że każdy z nas miał okazję, jeśli nie uczestniczyć, to chociaż słyszeć o podobnym zdarzeniu.

Zacznijmy jednak od początku. Dlaczego ktoś taki jak ja, młody naukowiec, chemik analityk zaczyna swój artykuł od opisu nastroju panującego na sali sądowej? Już spieszę z wyjaśnieniami.

(Nie?) ostatnia wola

W toku omawianej sprawy powódka Marta B. – wnuczka wspomnianej starszej pani – wnosi o przyznanie jej prawa do posiadłości po zmarłej krewnej. Według przedstawionego przez nią odręcznego testamentu, leciwa kobieta pragnęła rzekomo „przekazać majątek obejmujący 5 hektarów ziemi, dworek i stajnie pani Marcie B.”, swojej „najukochańszej wnuczce”. Brat powódki twierdzi jednak, że dokument ten nie zawiera zdania o takiej treści i że on jest prawnym spadkobiercą połowy włości. Jako dowód dostarcza drugi odręczny testament. Diagnoza: podejrzenie fałszerstwa. Przedsięwzięte działania: sędzia postanawia sprawdzić autentyczność kwestionowanych dokumentów, pełnomocnicy pokrzywdzonej włączają do sprawy prokuraturę, zostają zlecone specjalistyczne ekspertyzy.

W pierwszej kolejności testamenty poddane są nieniszczącym badaniom optycznym z użyciem różnorakich urządzeń powiększających oraz działaniu promieniowania elektromagnetycznego (w zakresie światła widzialnego, ultrafioletu i podczerwieni). Wyniki analiz nie są jednak jednoznaczne, materiały kryjące z obydwu dokumentów wykazują zbliżoną charakterystykę. Powstają więc wątpliwości co do ich podobieństwa. Za zgodą sądu biegli postanawiają zastosować badania niszczące, a więc powodujące utratę niewielkiej ilości dowodu. Do pracy przystępują specjaliści z zakresu metod spektroskopowych oraz chromatograficznych.

W tym momencie na pole walki wkraczam również ja – zbrojny mąż nauki z moim niezawodnym koniem bojowym w postaci elektroforezy kapilarnej oraz orężem pipet, kolb i fiolek. Dostaję do ręki testamenty, czuję wszechogarniające mnie napięcie… Otrzymane dowody nie rozczarowują mnie, będzie ciekawie. Patrzę na dwa dokumenty, pozornie podobne, ten sam charakter pisma, tylko nieco inna treść. Coś jest na rzeczy… Czyżby babcia sporządziła dwie wersje ostatniej woli, dla każdego wnuczka według jego upodobań?

Zabieram się do pracy. A jest do czego!

Sherlock Holmes – Kopciuszkiem

Wysoko sprawna elektroforeza kapilarna jest metodą fascynującą. Stwarza, można by rzec, nieograniczone możliwości i dzięki temu cieszy się dużym zainteresowaniem. Wymaga jednak pewnego przygotowania próbki. W przypadku analizy naszych testamentów konieczne jest wyekstrahowanie materiału kryjącego z papierowego podłoża. W życiu codziennym spotykamy się z podobnym zjawiskiem podczas prania odzieży, tyle że wtedy substancje tworzące plamę odseparowujemy, żeby się ich pozbyć, natomiast w trakcie badania dokumentu materiał kryjący wyizolowujemy w celu analizy.

Przygotowanie próbki wymaga zdolności dedukcji Sherlocka Holmesa zintegrowanych z umiejętnościami manualnymi Kopciuszka. Dlaczego? Testament jako dowód w sprawie musi być zachowany w jak najlepszej kondycji, nawet jeżeli zostaje poddany analizom niszczącym. Uzbrojona więc w mikroskop stereoskopowy (ewentualnie szkło powiększające) oraz specjalnie skonstruowaną strzykawkę z przyciętą na równo, zaostrzoną igłą do zastrzyków pobieram materiał do analizy z wytypowanych wcześniej fragmentów linii pisma. Oczywiście, kartka po tym zabiegu nie wygląda jak ser szwajcarski, nie wygląda także jak sito. Jedynie wprawne oko patrzące „pod światło” zdolne jest zauważyć wycięte punkty. Głównie ze względu na ich wymiar, mają one wielkość przysłowiowego łebka od szpilki, ich średnica wynosi 0,45 mm. Ponadto, jak się domyślacie, rozrośnięcie się populacji dziurek w siłę, uzależnione jest od woli laboranta, a ja, mając na uwadze dobro dokumentu, nie pozwalam na nadmierny, nieuzasadniony wzrost ich liczebności.

Wróćmy jednak do konkretów, pobrane krążki umieszczam w malutkiej szklanej fiolce i dodaję wodnego roztworu pirydyny, odczynnika ekstrahującego o bardzo „smrodliwym” zapachu. Fiolka wędruje do łaźni ultradźwiękowej, ze względu na wydawane dźwięki zwanej potocznie „zemstą nietoperza”; zabieg ten ułatwia barwnikom opuszczenie papieru i przejście do roztworu. Następnie mikrostrzykawką oddzielam ekstrakt od papierowych fusów i przenoszę go do nowej fiolki. Odparowuję cały rozpuszczalnik podgrzewając „od dołu” i przedmuchując azotem „od góry”. W ostatnim etapie rozpuszczam stałą pozostałość w 10 µl MEE (świadomie użyłam skrótu, dla bardziej wtajemniczonych posiadających giętki język: metoksyetoksyetanol) i rozcieńczam 20 µl mieszaniny zawierającej: Brij−35 (środek powierzchniowo czynny, z wymówieniem jego pełnej nazwy sama mam problemy), kwas mrówkowy i wodorotlenek sodu.

Trudne? A to dopiero początek… Kolejny krok analizy to przeprowadzenie separacji elektroforetycznej z detekcją w UV. Zaraz, zaraz – powie ktoś z was – cóż to znaczy? Postaram się wyjaśnić.

Last Minute do wnętrza CE

Kiedy zastanawiałam się, jak w prosty sposób przedstawić zasadę działania tej metody, przypomniałam sobie sen mojego kolegi ze studiów. Prowadził on pomiary wykorzystując chromatografię gazową, był zafascynowany tą techniką i bardzo przejęty swoją pracą. Pewnej nocy przyśniła mu się droga, jaką przebywa analit (analizowana substancja) po wprowadzeniu do aparatury; co więcej, we śnie on sam był analitem! Pomyślałam, że właśnie z perspektywy małej cząsteczki wędrującej przez poszczególne elementy instrumentu najlepiej poznamy prawa rządzące zjawiskiem elektroforezy.

Gotowi na zgłębienie tajników CE (czyt. elektroforezy kapilarnej)? Zacznijmy więc naszą wędrówkę. Będę waszym przewodnikiem. Zwiedzimy PrinCE’a 550 z detektorem spektrofotometrycznym UV−Vis Lambda 1010.

Trochę wyobraźni i, już zmniejszeni, jesteśmy cząsteczkami analizowanych substancji. Każdy z nas ma inną budowę, jesteśmy różnej wielkości, jedni z nas posiadają ładunek, inni nie. Nie, nie chodzi o ładunek wybuchowy. Żadnych bomb! Miałam na myśli ładunek elektryczny przejawiający się oddziaływaniem elektromagnetycznym ciał. Jednym słowem tworzymy mieszaninę różnorakich indywiduów – by nie wypaść z torów naszej kryminalistycznej ekspertyzy – głównie barwników obecnych w materiałach kryjących.

Znajdujemy się w fiolce, pojemniku o objętości 250 µl. Podnieśmy głowy do góry, widzimy wylot kapilary ze stopionej krzemionki: dla nas – olbrzymia dziura o średnicy 50 µm, za którą czeka nas 85−centymetrowa jazda. Proszę się przygotować, zaraz nastąpi wprowadzenie próbki do kapilary! Wepchnie nas przyłożone ciśnienie. To najczęściej stosowany sposób, wykorzystujący różnice ciśnień na końcach kapilary, zwany hydrodynamicznym. Rzadziej wykorzystywany jest nastrzyk elektrokinetyczny, gdy zjonizowane składniki próbki wpływają do kapilary dzięki swojej ruchliwości elektroforetycznej i przepływowi elektroosmotycznemu (wyjaśnienie pojęć nastąpi później). Zaraz poczują Państwo siłę kierującą do wlotu kapilary. Spotkamy się na miejscu, w jej środku. Uwagaaa…

Jesteśmy. Cali i zdrowi? Pewnie Państwo zauważyli, że nie wszyscy są obecni, to naturalna kolej rzeczy. Całkowita objętość stosowanych kapilar wynosi kilka mikrolitrów, aby uniknąć przeładowania, nasza grupa (długość strefy próbki) nie może być większa niż 1−2 proc. całkowitej długości kapilary, a więc odpowiednio objętości 1−50 nl.

Będziemy się poruszać z różną prędkością, zależną od charakteryzujących nas ruchliwości elektroforetycznych. Co tu dużo mówić – puszyści zostaną z tyłu. W świecie cząsteczek na ruchliwości te wpływają ładunek i promień cząsteczek analitu, a także właściwości buforu separacyjnego (roztworu wypełniającego kapilarę, dzięki któremu pH utrzymywane jest na stałym poziomie).

Po przyłożeniu napięcia, poza przepływem elektroforetycznym będziemy odczuwać również oddziaływanie elektroosmozy (EOF) – zjawiska elektrokinetycznego przepływu cieczy wypełniającej kapilarę. Kiedy siła EOF jest o wiele mocniejsza od ruchliwości elektroforetycznej, wszystkie komponenty analizowanej mieszaniny pchane są w kierunku katody (elektrody o ładunku ujemnym). Zaraz będziemy mieć okazję odczuć omawiane zjawisko na własnej skórze. Na przód peletonu wysuną się „Kationy” (Państwo z ładunkami dodatnimi), później zaobserwujemy pęd „Neutralnych” (nie posiadających ładunku), ostatnia do mety dotrze grupa „Anionów” (Państwa obdarzonych ładunkiem ujemnym).

Dodatkowo wśród poszczególnych grup także nastąpi zróżnicowanie szybkości przepływu. Wykupili Państwo bilety na jedną z technik wysoko sprawnej elektroforezy kapilarnej, na micelarną elektrokinetyczną chromatografię kapilarną. Zasada rozdziału w tej technice opiera się na powinowactwie („zamiłowaniu”) analizowanych substancji do fazy micelarnej, nazywanej często pseudostacjonarną. Oddziaływanie z fazą micelarną zarówno tych z Państwa obdarzonych ładunkiem, jak i tych ubogich w tym względzie, pozwoli na lepszą separację pierwszych (składników jonowych) i umożliwi rozdzielenie drugich (składników obojętnych).

Trudno uwierzyć? Sami się Państwo przekonają… Kiedy na czekającej nas drodze napotkają Państwo micelę… A tak, oczywiście, już mówię… Micela to… to jest jak z dziećmi… W domu potrafią bawić się same. W przedszkolu, gdzie jest ich więcej, tworzą „kółka wzajemnej adoracji” i bawią się w grupach. Związki powierzchniowo czynne ulegają podobnym tendencjom, gdy ich stężenie przekracza pewną wartość graniczną, tworzą agregaty o rozmiarach koloidalnych – nasze micele. Mogą Państwo czuć pragnienie zagłębienia się w ich wnętrzu lub przeciwnie, oddalenia się od nich. Im bardziej hydrofobowy nasz charakter, tym silniejsze oddziaływanie z micelami i tym bardziej prędkość naszej wędrówki zbliżona będzie do ich prędkości migracji.

Proszę zachować ostrożność. Dostałam wiadomość z centrali, przyłożono napięcie. Czują Państwo ciepło? Proszę się nie bać, wykwalifikowany analityk nie pozwoli na wzrost niekorzystnego efektu generowania ciepła Joule’a. To, co Państwo odczuwają, to pozytywna temperatura utrzymywana na stałym poziomie dzięki termostatowaniu kapilary. Pomoże nam szybciej dotrzeć do celu, do detektora. Przez 45 minut proszę się nie opierać oddziałującym na Państwa siłom i poruszać się z odpowiadającą Państwu prędkością. Aha, proszę się nie przepychać w detektorze, zachować kolejność, w jakiej Państwo dopłynęli. To bardzo ważne. Nie, nic nie trzeba robić, tylko pokonać okienko detekcyjne, gdzie zaabsorbują Państwo odpowiednią dawkę padającego promieniowania UV−Vis. Nie jest to szczególnie groźne. Zbiórka w fiolce za detektorem.

Dowody zbrodni

Pobudka! Wracamy do rzeczywistości, mam nadzieję, że podróż w nanoświecie nieco przybliżyła wam metodę elektroforezy kapilarnej. Podobną drogę pokonały barwniki wchodzące w skład materiałów kryjących analizowanych testamentów. Elektroferogram (wykres zależności sygnału detektora od czasu) materiału kryjącego jednego z dokumentów wykazał duże podobieństwo do elektroferogramu z bazy profili elektroforetycznych atramentów drukarkowych. Jakie wnioski? Jeden testament jest imitacją dokumentu wykonanego pismem ręcznym. Prawdopodobnie został sfałszowany techniką kolażu komputerowego pozwalającą na wytworzenie tekstu, na który składają się fragmenty innych tekstów (np. listu czy listy zakupów).

Zastanawiacie się który? Wnuk czy wnuczka? Które z nich myślało, że papier przyjmie wszystko? Cierpliwości… Może przeczytacie o tym w jutrzejszej gazecie…

Tło sytuacyjne jest fikcyjne, a wszelka zbieżność postaci i wydarzeń z postaciami i wydarzeniami rzeczywistymi jest niezamierzona i przypadkowa.