Rozwiązanie, które umożliwia celowanie w powierzchnię bakteriofaga poprzez oddziaływania elektrostatyczne, opracowali naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN. To obiecująca strategia dezaktywacji fagów bez negatywnego wpływu na szczepy bakteryjne lub komórki eukariotyczne.
Kilkadziesiąt lat temu antybiotyki były uważane za cudowne leki zdolne wyleczyć infekcje bakteryjne. Niestety, ich nadużywanie doprowadziło do rozwoju oporności na antybiotyki u wielu szczepów bakterii chorobotwórczych. Jednym z rozwiązań pozwalających zwalczyć te patogeny są bakteriofagi, zwane również fagami. Chociaż fagi są badane jako nowoczesne środki terapeutyczne w medycynie, ich obecność jest wysoce niepożądana w laboratoriach i procesach przemysłowych, które opierają się na starannie kontrolowanych hodowlach bakterii.
W wielu sektorach przemysłowych, w tym w produkcji żywności fermentowanej, enzymów, farmaceutyków i kosmetyków, określone szczepy bakterii są niezbędne do wydajnej i powtarzalnej produkcji. W tych warunkach bakteriofagi stanowią poważne zagrożenie, ponieważ mogą selektywnie infekować i eliminować szczepy produkcyjne, a to prowadzi do strat partii produkcyjnych i tym samym znacznych strat ekonomicznych. Fagi mogą również mieć niekorzystny wpływ na rolnictwo lub środowisko, np. podczas oczyszczania ścieków, gdzie ich obecność może wpływać na populacje mikroorganizmów. Co więcej, w kontrolowanych bioprocesach ich niekontrolowane rozprzestrzenianie się jest szczególnie szkodliwe.
Pomimo niewielkich rozmiarów bakteriofagi są bardzo trwałe i mogą łatwo rozprzestrzeniać się w środowiskach laboratoryjnych i przemysłowych. Mogą być wprowadzane przez zanieczyszczone surowce, nieodpowiednio zdezynfekowany sprzęt, powierzchnie, a nawet powietrze. Po pojawieniu się mogą szybko rozprzestrzeniać się w hodowlach bakteryjnych, często pozostając niewykrytymi, aż do momentu uszkodzenia całej populacji bakterii. Aby zapobiec zanieczyszczeniu fagami, laboratoria i fabryki stosują rygorystyczne protokoły higieniczne obejmujące metody sterylizacji i dezynfekcji, takie jak promieniowanie UV-C, wysoka temperatura i ciśnienie, ozon oraz agresywne chemikalia, w tym nadtlenomonosiarczan potasu (Virkon), etanol, a nawet wybielacze i nadtlenek wodoru. Podejścia te mają zazwyczaj na celu uszkodzenie białek kapsydowych fagów lub kwasów nukleinowych, a tym samym unieszkodliwienie wirusa. Jednak bakteriofagi mogą się agregować, zwiększając swoją odporność na trudne warunki środowiskowe, takie jak ekspozycja na ciepło lub chemikalia. Ponadto fagi są często bardziej odporne niż same bakterie. W rezultacie metody dezynfekcji wystarczająco silne, aby wyeliminować fagi, często niszczą szczepy bakterii niezbędne w procesach przemysłowych. Ten brak selektywności stanowi istotne ograniczenie istniejących strategii zwalczania fagów i motywuje do poszukiwania bezpieczniejszych i skuteczniejszych rozwiązań.
W odpowiedzi na te wyzwania interdyscyplinarny zespół naukowców z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk zaproponował rozwiązanie, które umożliwia selektywne zabijanie fagów bez szkodliwego wpływu na bakterie. Oparte jest na polimerowych nanosferach o dobrze zdefiniowanej powierzchni, która wchodzi w interakcję z bakteriofagami. Jak to działa?
Bakteriofagi posiadają charakterystyczne ładunki na powierzchni, które różnią się od ładunków komórek bakteryjnych i eukariotycznych. Naukowcy zaprojektowali nanocząstki polipirolowe (NP), które oddziałują bezpośrednio z ładunkami na powierzchni fagów poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Ponieważ błony biologiczne bakterii i komórek ludzkich mają inne właściwości powierzchniowe niż bakteriofagi, nie ulegają one wpływowi, a naładowane nanocząsteczki polipirolowe działają selektywnie na fagi.
Pokazaliśmy, że selektywną aktywność antyfagową można osiągnąć za pomocą nanocząstek polimerowych, które stanowią znacznie tańszą i skalowalną alternatywę dla innych rozwiązań nanostrukturalnych, takich jak systemy oparte na złocie – komentuje dr hab. Piyush Sindhu Sharma z IChF PAN.
Proponowane nanocząsteczki mają średnicę około 50 nm i zawierają na swojej powierzchni określone grupy funkcyjne, a mianowicie ujemnie naładowane grupy karboksylowe, które wzmacniają oddziaływania elektrostatyczne z bakteriofagami. Naukowcy kontrolowali gęstość tych grup podczas produkcji poprzez polimeryzację mieszanin pirolu z grupami karboksylowymi i bez nich. Co ważne, zidentyfikowali oni optymalny skład powierzchni wymagany do skutecznej dezaktywacji fagów. Gdy zawartość jest zbyt mała lub zbyt wysoka, efekt może ulec pogorszeniu. Spośród wielu różnych stechiometrii między czystym pirolem a pirolem zmodyfikowanym grupami karboksylowymi, 1% zawartość grup karboksylowych w uzyskanych nanocząstkach jest wystarczająca do dezaktywacji nawet 95% fagów.
W naszym badaniu proponujemy nanocząstki polipirolowe funkcjonalizowane w 1% grupami karboksylowymi jako ukierunkowane rozwiązanie do inaktywacji fagów ze względu na ich właściwości przeciwwirusowe. Ich wysoka skuteczność w połączeniu z prostą metodą syntezy stwarza możliwość późniejszego wykorzystania na większą skalę – dodaje Dominik Korol z IChF PAN.
Badacze najpierw potwierdzili aktywność przeciwwirusową nanocząstek wobec bakteriofagów, a następnie ocenili ich wpływ na bakterie wystawione na działanie fagów poddanych ich działaniu. Wyniki badań pokazują, że proponowane nanocząstki skutecznie chronią bakterie przed fagami. Co ważne, sprawdzono również, czy dezaktywacja fagów jest odwracalna. Obecność grup karboksylowych w nanocząstkach w opisanej zawartości skutecznie zakłóca podstawowe funkcje fagów, takie jak rozpoznawanie i przyczepianie się do powierzchni. Badania cytotoksyczności przeprowadzone na fibroblastach wykazały, że nanocząstki były biokompatybilne w stężeniach, w których dezaktywują fagi. Nieodwracalna dezaktywacja fagów wraz z niewielką cytotoksycznością wskazuje ogromny potencjał proponowanych nanocząsteczek w zastosowaniach biotechnologicznych, przeciwbakteryjnych i medycznych.
Dlaczego temat ten jest tak ważny? Proponowane podejście różni się od powszechnie stosowanych metod stosowanych w przemyśle i laboratoriach, takich jak pasteryzacja lub dezynfekcja chemiczna przy użyciu wyżej wymienionych agresywnych związków. Proponowane nanocząstki mogą być stosowane na różnych etapach procesów przemysłowych bez konieczności ich wprowadzania bezpośrednio np. do fermentatorów, poprawiając ochronę w procesach biotechnologicznych.
Połączyliśmy naszą wiedzę z różnych dziedzin, tworząc wysoce skuteczną i selektywną strategię, która upraszcza kontrolę fagów. Nasze cząstki minimalizują koszty i obawy dotyczące bezpieczeństwa oraz oferują praktyczne zastosowanie w bioprocesach wielkoskalowych, w których niekontrolowana obecność fagów jest szczególnie szkodliwa – zauważa Sada Raza z IChF PAN.
Zrozumienie mechanizmów stojących za unieszkodliwianiem bakteriofagów wymagało interdyscyplinarności, łączącej metody z różnych dziedzin, od wirusologii po chemię polimerów. Umożliwiło to zaprojektowanie nanocząstek o kontrolowanej wielkości oraz ładunku przyczepiających się do określonej powierzchni. Połączenie różnych dziedzin doprowadziła do opracowania rozwiązania, które może pomóc w kontrolowaniu zanieczyszczenia fagami w laboratoriach i wielkoskalowych procesach technologicznych.
Wyniki badań zespołu z Instytutu Chemii Fizycznej PAN ukazały się na łamach „Materials & Design”.
dr Magdalena Osial, źródło: IChF PAN
Mam nadzieje ze ten "strzelec" ze zdjecia nigdy nie strzela z prawdziwej broni. Bo sobie lub komus zrobi kuku. Tak sie pistoletu nie trzyma.
I tak trzeba się z hodowli pozbyć komórek bakterii, które produkują te bakteriofagi. Działanie tylko na etapie bakteriofaga niewiele pomoże. Do tego proponujecie wprowadzenia nowego, raczej nieusuwalnego zanieczyszczenia do produktu fermentacji.
Czy nie lepiej już stosować do fermentacji genetycznie modyfikowane bakterie które są odporne na wybrane bakteriofagi?
Polecam przyjrzeć się systemowi CRISPR-Cas - to naturalny system oporności na bakteriofagi występujący u bakterii.