Możliwość kontrolowania stopnia podobieństwa w przypadku cząstek wirusopodobnych czyni z nich niezwykle interesujące obiekty, stosowane zarówno w badaniach podstawowych, jak i jako materiał szczepionkowy.
Czytelnicy, którzy przeżyli czasy PRL, mogą pamiętać niektóre produkty spożywcze, jakich dziś już nie ma. Wśród nich są (na szczęście) wyroby „czekoladopodobne”. Zarówno w wyglądzie, jak i smaku była to niby czekolada, ale próżno w tym rzekomym smakołyku byłoby szukać podobieństwa do prawdziwej czekolady. Paradoksalnie podobnie rzecz się ma w przypadku zarówno cząstek wirusopodobnych (dalej w skrócie zwanych VLP – od ang. virus-like particles), jak i sztucznych systemów błonowych, które wykorzystywane są w naszych badaniach. Podobnie jak te smakołyki sprzed lat posiadają one niektóre cechy obiektów wzorcowych. Ponadto wybór cech podobieństwa można w dużym stopniu kontrolować. To selektywne naśladowanie natury, której złożoność w wielu miejscach uniemożliwia jej badanie, dobrze wpisuje się we współczesne nurty biologii syntetycznej.
Być podobnym do wirusa, czyli właściwie do czego?
Przedstawmy teraz wytwór „wirusopodobny”, jakim są cząsteczki wirusopodobne (VLP). Czym w ogóle są wirusy? Chociaż niedawna pandemia COVID-19 uaktualniła naszą wiedzę na ten temat, warto wspomnieć dość powszechnie znaną definicję popularnonaukową, mówiącą, że wirus to „garść informacji zapakowanych w białka”. I choć to duże uproszczenie, porównanie to charakteryzuje wszystkie naturalne cechy wirusów. Warto jeszcze nadmienić, że owa informacja dla infekowanej komórki jest zawsze zła. Zawiera ona bowiem wiadomości dotyczące budowy wirusowych białek, których kopie wytwarzane są w trakcie dalszych etapów infekcji. To właśnie „informacja”, czyli materiał genetyczny wirusa, jest elementem zakaźnym, więc także potencjalnie groźnym dla wszystkich, którzy mają z nim bezpośredni kontakt.
W przypadku wirusa grypy, który jest naszym głównym obiektem zainteresowań badawczych, oprócz „białek zamykających informację” (w przypadku wirusa grypy to jednoniciowy kwas ssRNA(-)), występuje jeszcze tzw. otoczka. To fragment błony komórkowej, w którą wirus „opakowywany” jest podczas wychodzenia z komórki. Wirusy otoczkowe mają na swojej powierzchni także własne białka, które pełnią istotne funkcje. To właśnie od kształtu utworzonego przez białka rodzina koronawirusów, znana wszystkim dobrze z pandemii COVID-19, wzięła swoją nazwę. Po wybuchu pandemii agencja zajmująca się przechowywaniem i publikowaniem strukturalnych danych białkowych (RCSB PDB, ang. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, Protein Data Bank) wypuściła serię materiałów informacyjnych dedykowanych dla różnych grup wiekowych odbiorców.
Syn jednego ze współautorów (RW), jako sześciolatek kolorujący obrazek przedstawiający budowę koronawirusa SARS-CoV2 (Rys. 1), powiedział: „Tata, to są drzewa!”. I rzeczywiście jest to dobra analogia (obiecujemy, że ostatnia w tym tekście…). Drzewa przecież potrzebują swoich zewnętrznych części – gałęzi z liśćmi, w których zachodzi fotosynteza – żeby zapewnić sobie podstawowe funkcje życiowe. Ale zakotwiczone są w glebie swoim systemem korzeniowym, bez którego nie mogłyby czerpać niezbędnych do życia składników mineralnych. Podobnie jest w przypadku otoczkowych białek wirusowych. Swoje funkcje realizują za pomocą fragmentów zlokalizowanych w części zewnątrzbłonowej (tzw. ektodomenie, ang. ectodomain), ale umiejscowione są w otoczce wirusowej za pomocą tzw. części transbłonowej (w skrócie TMD od ang. transmembrane domain) niczym drzewa zakotwiczone korzeniami w glebie.
Po co badać białka wirusów otoczkowych? Gdy popatrzeć na mnogość prac naukowych dotyczących fuzyjnego białka grypy, jakim jest hemaglutynina, można odnieść wrażenie, że nic w tym temacie nowego nie ma do powiedzenia. Dodając sformułowania pojawiające się w przeglądach literatury, mówiące, że „hemaglutynina jest jednym z najlepiej przebadanych białek wirusowych”, można tylko utwierdzić się w tym przekonaniu. Jednak proces fuzji błonowej, czyli łączenia się dwóch fragmentów błon, skrywa jeszcze wiele tajemnic. W szczególności niewiele wiadomo na temat roli „systemu korzeniowego” hemaglutyniny: czy w ogóle pośredniczy w procesie fuzji; jeśli tak, to jaka jest jego rola? Należy nadmienić, że fuzja błonowa jest procesem, który musi zachodzić we wszystkich wirusach otoczkowych i jest dla nich kluczowy, ponieważ to właśnie fuzja błonowa umożliwia uwolnienie materiału genetycznego do wnętrza komórki. I tu wykorzystujemy cechę cząstek VLP – występowanie białka fuzyjnego zakotwiczonego w otoczce, przy jednoczesnym całkowitym braku materiału genetycznego. Gdy dodać do tego możliwość wytworzenia różnych form (mutacji) białka, otwiera się szerokie spektrum możliwości badawczych. Zanim jednak przedstawimy jedną z cech hemaglutyniny, jaką jesteśmy zainteresowani w projekcie, przedstawimy krótko sposób, w jaki można otrzymać cząsteczki VLP.
Zielono mi
Sposób ten jest o tyle ciekawy, że do wytwarzania cząsteczek VLP mogą być wykorzystywane rośliny. W pierwszym etapie DNA zawierające kod genetyczny wirusowego białka jest sztucznie syntetyzowane w postaci plazmidu DNA, którym transformowane są bakterie Agrobacterium. Potem następuje transfer zawiesiny bakteryjnej do młodych (ok. czterotygodniowych) roślin tytoniu Nicotiana benthamiana (Rys. 2). Odbywa się to przez odwrócenie i zanurzenie rośliny w roztworze z bakteriami w komorze o obniżonym ciśnieniu. Następnie, podczas wzrostu rośliny, następuje przejściowe wbudowanie materiału genetycznego z plazmidu bakteryjnego do genomu tytoniu. W ten sposób roślina wytwarza wirusowe białko. Co więcej, umiejscowione jest ono na powierzchni pęcherzyków utworzonych z lipidów roślinnych, które wydzielane są w swoistych „kieszonkach” między błoną a ścianą komórkową komórek liści. Stąd droga do uzyskania cząsteczek VLP jest już stosunkowo prosta: wystarczy zerwać liście, zmiksować je w buforze wodnym, przefiltrować, a następnie w miarę standardowymi metodami biochemicznymi (np. ultrawirowaniem w gradiencie sacharozy) można uzyskać zawiesinę cząsteczek VLP. Co ciekawe, średnica takich cząstek, którą możemy mierzyć za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS, ang. dynamic light scattering) pokrywa się również ze średnicą wirusów, wynoszącą ok. 100 nm. Więc podobieństwo do wzorca jest całkiem zauważalne.
Po co to wszystko?
Co udało nam się wywnioskować z dotychczasowych badań? Od początku naszą uwagę przyciągał fakt różnorodności części „korzennej”, czyli TMD grypowej hemaglutyniny należącej do tzw. podtypu H1 i H3. To właśnie te dwa podtypy stanowią obecnie występujące patogeny ludzkie. O ile części „korony” drzew są podobne pomiędzy podtypami H1 i H3, to właśnie części oddziałujące z otoczką różnią się znacznie od siebie. Jak wpływa to na sposób funkcjonowania białka?
Stosując inne sztuczne systemy błonowe, takie jak liposomy, czy sztucznie „wspierane” dwuwarstwy lipidowe (SLB, ang. supported lipid bilayers), badaliśmy zdolności do pośredniczenia fuzji błonowej hemaglutyniny zawierające „systemy korzeniowe” pochodzące z obu podtypów. Okazało się, że fragment transbłonowy jednego z podtypów grypy jest bardziej uniwersalny, w tym sensie, że białko jest w stanie pośredniczyć fuzji błon o zróżnicowanym składzie. Co więcej, w porównaniu do drugiego podtypu jest mniej „czułe” na zmianę otoczenia lipidowego, w analogii roślinnej jest mniej wymagające odnośnie do gleby, w jakiej rośnie. Właśnie tu warto nadmienić, że białko–drzewo otrzymane w postaci cząstek wirusopodobnych może mieć zmienioną glebę, czyli obrazowo może być „przesadzone” do innej doniczki. Robi się to w skrócie tak, że przygotowuje się liposomy o pożądanym składzie, czyli miesza lipidy rozpuszczone w chloroformie, odparowuje się go i uwadnia roztworem wodnym.
Po okresie inkubacji, której towarzyszy gwałtowne wstrząsanie, zawiesinę taką poddaje się kilku cyklom mrożenia w ciekłym azocie i rozmrażania. Na tym etapie formują się pęcherzyki wielowarstwowe, które następnie przeciskane są przez nitrocelulozowe błony o określonym rozmiarze porów. Dzięki temu otrzymuje się jednowarstwowe (czyli tzw. unilamelarne) pęcherzyki o dobrze określonym rozmiarze. Chcąc „przesadzić” drzewo do takiej gleby, inkubuje się oczyszczone białko oraz liposomy z dodatkiem detergentu, który „spulchnia” ową glebę. Kolejnym etapem jest pozbywanie się detergentu przez dializę, czyli odpłukiwanie go przez rozpuszczanie w dużej objętości, przy jednoczesnym zamknięciu białka i liposomów w małym woreczku. Dzięki temu białko wbudowuje się w błonę liposomu. Wyniki, o których tu wspominamy, są obecnie przygotowywane do publikacji w postaci artykułu naukowego.
W stronę zastosowań
Czy cząstki wirusopodobne są pomocne tylko w badaniach naukowych? Cząstki mają na swojej powierzchni białka wirusowe, które są najczęściej elementami, przeciwko którym powstaje reakcja immunologiczna, a jednocześnie pozbawione są „złej informacji”, czyli materiału genetycznego. Okazuje się, że świetnie się sprawdzają jako potencjalne szczepionki. Pierwszą na rynku dostępną szczepionką zawierającą cząstki wirusopodobne była szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu typu B (HBV). Została zatwierdzona do komercyjnego użytku w USA już w 1986 roku.
Obecnie dostępnych jest kilka szczepionek opartych na VLP w różnych krajach. Oprócz szczepionki na HBV dostępne są do użytku szczepionki na wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV): Ceravix (GSK) oraz Gardasil (Merck). Dostępna jest także szczepionka przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A (HAV) Epaxal (Crucell). Natomiast w Chinach została dopuszczona do użytku dla pacjentów szczepionka na wirusowe zapalenie typu E (HEV). Obecnie zostały już zakończone testy kliniczne w fazie trzeciej na szczepionkę opartą na cząstkach przeciw wirusowi grypy produkowanej w roślinach (NCT03321968) oraz wirusowi chikungunya (NCT05349617). Wirus chikungunya jest przenoszony przez komary, objawia się gorączką i bólami stawów. Osłabienie oraz bóle stawów mogą utrzymywać się latami po zachorowaniu. Zakończono także drugą fazę badań klinicznych szczepionki VLP na norowirusy (NCT02153112). Norowirusy wywołują zakażenie przewodu pokarmowego szczególnie niebezpieczne dla dzieci poniżej piątego roku życia. W drugiej fazie testów klinicznych są badane szczepionki oparte na VLP przeciw syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV) oraz metapneumowirusowi (RSV/hMPV) (NCT05903183). Choroby wywołane przez RSV oraz hMPV objawiają się ostrymi infekcjami dróg oddechowych u dzieci poniżej jednego roku życia oraz osób powyżej 65 lat.
Co więcej, poza wykorzystaniem VLP jako szczepionek w chorobach wirusowych prowadzone są badania nad wykorzystaniem w leczeniu chorób niezakaźnych. W tych przypadkach wykorzystuje się białko wirusa razem z innymi białkami, które znajdują się na powierzchni cząstki wirusopodobnej. W 2021 roku rekomendacje WHO dostała szczepionka Mosquirix dostępna dla dzieci w wieku 6 tygodni do 17 miesięcy. Szczepionka jest oparta na cząstkach wirusopodonych, na powierzchni cząstek znajduje się białko wirusa HBV oraz białko zarodźca malarii. Oprócz tego szczepionki VLP mogą być wykorzystane jako immunoterapia w leczeniu nowotworów, aktualnie trwa faza druga i trzecia badań klinicznych szczepionki opartej na VLP razem z lekiem stosowanym u pacjentów z nowotworami, niwolumabem. Testy kliniczne są prowadzone w terapii przeciw zaawansowanemu czerniakowi (NCT04695977). Zakończono także drugą fazę szczepionek dla pacjentów onkologicznych z zaawansowanym rakiem trzustki z wykorzystaniem tych samych cząstek VLP razem z przeciwciałami (NCT 04387071). Oprócz wcześniej wymienionych zastosowań wykorzystuje się szczepionki w leczeniu chorób wirusowych, malarii i chorób nowotworowych. Prowadzone są także liczne badania przedkliniczne wykorzystania VLP do leczenia m.in. choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i alergii.
Jak dwie krople wody?
Niekoniecznie. Ale to właśnie możliwość kontrolowania stopnia podobieństwa w przypadku cząstek wirusopodobnych czyni z nich niezwykle interesujące obiekty, stosowane zarówno w badaniach podstawowych, jak i jako materiał szczepionkowy.
mgr Paulina Borkowska i dr hab. Remigiusz Worch
Pracownia Biofizyki Komórki
Instytutu Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN w Warszawie
Opisane badania prowadzone są w ramach projektu badawczego Narodowego Centrum Nauki Sonata Bis „Peptydy fuzyjne i segmenty transbłonowe wybranych wirusów otoczkowych: struktura, dynamika oraz oddziaływania z błoną”.
