Z nauk jest troch tak, jak z poszukiwaniem przygd. Masz ustabilizowane ycie, wykonujesz codziennie swoje obowizki, czasem nawet odnosisz wraenie, e nic si nie dzieje i tak ju pozostanie. Ale sprbuj tylko wychyli nos poza swoje podwrko, a naukowa przygoda dopadnie ci na pierwszym zakrcie. Tak wanie byo ze mn. Na moj pierwsz podr w nieznane czekaam w dwudziestostopniowym mrozie, bo przeznaczenie, w postaci autokaru do Danii, spniao si dobre 4 godziny. Pierwszy raz wyjedaam za granic na duej ni dwa tygodnie i, co tu kry, byam przeraona. Na szczcie nie sama. Byo nas troje.
„Ty, zobacz, wiedziaa?” – ukasz puka mnie nerwowo w rami za kadym razem, kiedy znalaz w czytanym artykule jak now informacj. Dla mnie zdobywanie nowej wiedzy zaczo si waciwie ju od samego tytuu. Haemophilus parainfluenzae. Tak, co kiedy syszaam o takiej bakterii, ale to by influenzae, skd ta para– na pocztku? Jaka pomyka w druku? Tak nazw mikroorganizmu przeczytaam w tytule widniejcym na okadce cienkiej ksieczki zawierajcej wszystko, co student zaczynajcy prac w laboratorium mikrobiologii medycznej powinien wiedzie o obiekcie bada. Za oknem pada nieg z deszczem, a my, w co najmniej wiosennych nastrojach, zaczynalimy wycieczk po laboratorium. Tam byo wszystko na wycignicie rki, mona byo wszystkiego dotkn. Mao tego, mona byo tego uy i nie sysze: „Uwaaj! Nie ruszaj, bo to drogie!”. Po prostu raj. Sam profesor oprowadza nas po swoim krlestwie, pokazujc, w jaki sposb czego uywa. Po ponaddwugodzinnej wdrwce kade z nas udao si do akademika obcione spor iloci makulatury do weekendowego czytania. Od tego si zawsze zaczyna.
By poniedziaek, a ja miaam wraenie, e znam tego obrzydliwego Haemophilusa od urodzenia. Dosownie, poniewa ta bakteria yje sobie w zgodzie z nami od momentu naszego pojawienia si na wiecie. Szczeglnie obficie wystpuje na bonach luzowych jamy ustnej i garda. Niby niegrona, a jednak okazuje si, e w sprzyjajcych warunkach moe spowodowa zapalenie garda, puc, a nawet opon mzgowych! Krtko mwic, hodujemy sobie mij na wasnym onie – mylaam ze zoci, czytajc informacj o kolejnym udokumentowanym przypadku zapalenia puc u dzieci, spowodowanym t „niewinn” bakteri.
Jeeli szczepy nale do tej samej grupy (biotypu), mog mie identyczne wyniki testw biochemicznych i wyglda identycznie pod mikroskopem. Jeli rni si na poziomie molekularnym (maj inn kolejno uoenia elementw skadowych DNA), po pociciu enzymami restrykcyjnymi w miejscu wystpowania okrelonej dla enzymu sekwencji (a) w elektroforezie uzyskamy inne wzory prkowe (b). Naley pamita, e fragmenty bdce osobnymi prkami w elu czy ta sama sekwencja, poniewa tylko tak moe rozpozna uyty do trawienia enzym.
Plan by taki: pobiera si wymazy z garda, jzyka i wewntrznej strony policzka patyczkiem do wymazw. Tak uzyskany materia bakteriologiczny wkada si nastpnie do pynnej poywki, ktra pozwala na wypukanie mikroorganizmw, dziki czemu otrzymujemy zawiesin nieuszkodzonych komrek. Potrzebne s nam ywe bakterie, aby wysia je na zamykane naczynko zwane pytk Petriego, zawierajce tzw. podoe selektywne. O co chodzi? Bakteria, eby rosn, potrzebuje pokarmu, tak jak my. Podoa s mieszanin niezbdnych dla niej skadnikw pokarmowych. Jeeli uyjemy podoa, na ktrym ronie wikszo bakterii, niewiele osigniemy, poniewa w eksperymencie interesuje nas konkretny gatunek. Musimy wic przeprowadzi selekcj mikroorganizmw, czyli doda do podoa takie skadniki, ktre umoliwi wzrost badanym bakteriom, hamujc jednoczenie rozwj wszystkich innych.
„Tego si nie je!” – dostaam po apach od Tove, naszej techniczki, w chwili, gdy prbowaam – jak na prawdziwego czekoladoholika przystao – wsadzi palec w steryln pytk, na ktrej smakowicie poyskiwaa ni mniej ni wicej tylko roztopiona Milka. Okazuje si, e podoem do izolacji Haemophilus parainfluenzae jest agar czekoladowy. No prosz, kto by pomyla, e bakterie te lubi czekolad! Nazwa tego medium pochodzi od smakowitego wygldu, na ktry daam si nabra. Do podoa dodaje si krew woow, ktra jest rdem niezbdnych do rozwoju tych bakterii aminokwasw. Cao poywki zestala si agarem, substancj, ktra po podgrzaniu jest pynna, ale w temperaturze pokojowej przemienia si w ciao stae. Komrki krwi s tu jednak rozbite w wyniku ich podgrzania, przez co podoe przybiera barw brzow, co na gadkiej agarowej pytce wyglda jak czekolada. Uzyskan zawiesin bakterii trzeba wysia na medium. W tym celu umieszcza si objto pynu, porwnywaln z gwk zapaki, na agarze i rozmazuje rwnomiernie po jego powierzchni. Pytki hoduje si w temperaturze nieco niszej od temperatury ciaa, poniewa w ustach cigle robimy sobie przecigi mwic, jedzc czy ziewajc. Ale to nie koniec, poniewa aby uzyska pewno, e pracujemy na czystym szczepie, czyli tylko jednym gatunku bakterii, naley przesia pojedyncze kropeczki bakterii zwane koloniami, na czyste pytki z agarem, uywajc metalowego drucika zwanego ez. Z reguy po dwukrotnym powtrzeniu procedury moemy mie pewno, e uzyskalimy czyst hodowl.
Po uporaniu si z posiewami przyszed czas na mikroskop. eby dostrzec bakterie w mikroskopie wietlnym, naley odpowiednio wybarwi ich struktury. Pod koniec XIX wieku duski uczony Gram opracowa stosowan do dzi metod barwienia bakterii. Jak to zrobi? Ot wiedzia, e ciana komrkowa bakterii zbudowana jest ze zwizku zwanego murein. Jak si okazao, zwizek ten moe budowa dwa rne w strukturze rodzaje cian – bardzo grub, w ktrej skad wchodz tylko acuchy mureiny lub duo ciesz, te mureinow, ale lec w przestrzeni pomidzy wewntrzn i zewntrzn bon, ktre chroni j przed wpywem niekorzystnych czynnikw. Rnice w budowie ciany narzucaj rn reakcj na barwniki, ktrymi na ni dziaamy. Uczony potraktowa mieszanin bakterii na szkieku mikroskopowym barwnikiem o nazwie fiolet krystaliczny, ale poniewa w komrkach chronionych zewntrzn bon mureina jest ukryta, barwnik nie przyczy si do acuchw tego zwizku i nie zabarwi komrki na fioletowo. Tylko grubocienne komrki bez dodatkowych oson uzyskay fioletowe zabarwienie. Dopiero kiedy wypuka mieszanin alkoholem i potraktowa barwnikiem o innej strukturze chemicznej, zwanym fuksyn, uzyska zabarwienie komrek, w ktrych mureina bya dodatkowo chroniona. Tak udao mu si dokona obowizujcego do dzi podstawowego podziau bakterii na gramdodatnie, czyli te, ktre barwi si na fioletowo, i gramujemne, ktre uzyskuj kolor rowy dopiero po zadziaaniu na nie fuksyn. Dziki temu najpowszechniej stosowanemu barwieniu moemy zobaczy ksztat bakterii. Idc ladem Grama postanowiam rwnie obejrze moj jzykow flor bakteryjn. Ubrudziwszy zlew i siebie wszystkimi moliwymi barwnikami popdziam do mikroskopu. No prosz, gramujemne, bo rowe, i do tego paeczki. Mam ju podstawowe wyniki identyfikacji. Czas na testy biochemiczne.
Identyfikacja biochemiczna opiera si na waciwociach metabolicznych bakterii. Mwic prociej, kada bakteria karmi si jedynie okrelonymi zwizkami chemicznymi i w zalenoci od kombinacji takich „da” mona utworzy profil biochemiczny gatunku. Nie powinno nas to dziwi, poniewa ju 150 lat temu Anthelme Brillar−Savarin napisa: „Powiedz mi, co jesz, a powiem ci, kim jeste”. Z bakteriami jest tak samo. W probwkach podajemy im rne rodzaje substancji, bdce potencjalnymi „przysmakami”, mieszajc je jednoczenie z barwnikami, aby obserwowa po zmianie koloru, czy bakteria „zjada” uyty w tecie zwizek. Jeli nastpuje zmiana barwy pynu w probwce, test ma wynik dodatni, jeli mieszanina pozostaje nietknita, analiza jest ujemna. Jeli nie mamy zupenie pojcia, z jakim mikroorganizmem mamy do czynienia, identyfikacja opiera si na dziesitkach testw. W naszym eksperymencie wystarczyy cztery analizy, by potwierdzi „tosamo” badanych organizmw i przyporzdkowa je do biotypu, podgrupy wewntrz gatunku.
Nie wyobraacie sobie, ile czasu zajmowao nam przygotowanie tych wszystkich probwek, korkw, barwnikw i podoy. Ale si opacao. Po dwch tygodniach przelewania, przesiewania, hodowania i sprawdzania testw uzyskalimy pierwsze interesujce wyniki. Znalelimy biotyp, ktry nie pasowa do adnego opisu. Prawdziwa gratka dla mikrobiologa! Nietypowe szczepy przesialimy na krwisty agar. W odrnieniu od agaru czekoladowego, komrki krwi w tym medium nie zostay wczeniej rozbite, dlatego agar ma ywy czerwony kolor. Po co takie kombinacje? Ot na agarze z rozbitymi komrkami krwi nie moemy obserwowa tzw. hemolizy, czyli rozpadu czerwonych ciaek krwi w wyniku dziaania rnych czynnikw (w tym przypadku toksyn bakteryjnych). Jeli interesuje nas, czy badane bakterie s grone dla zdrowia, musimy sprawdzi ich zdolno do powodowania takich objaww. Okazao si, e ten „dziwny Haemophilus” biotyp V ma zdolnoci hemolityczne, co objawiao si tworzeniem bezbarwnych stref agaru wok kolonii bakterii. Kto wie, moe ten szczep jest odpowiedzialny za zapalenie puc tych biednych dzieci, o ktrych czytaam? Trzeba to koniecznie sprawdzi. Tylko jak?
Nasz profesor zasta nas w pokoju w pozach mylicieli, wiszcych nad zeszytami penymi notatek. Prbowalimy znale metod, ktra pozwoli nam sprawdzi, czym rni si biotyp V typowy od nietypowego. Po wysuchaniu obszernego raportu, profesor powiedzia tylko jedno zdanie: „Zajrzymy tym bakterzyskom w DNA”. Jak to w DNA? – pomylaam z przeraeniem, poniewa wtedy nie miaam pojcia, jak si to robi i do tego niecay miesic wczeniej nauczyam si obsugiwa automatyczn pipet. Ale w dzisiejszej biologii bez analiz materiau genetycznego si nie obejdzie. Na szczcie dla chccego nic trudnego. Profesor kaza nam namnoy te dziwne szczepy w pynnej poywce i zwirowa tak, eby uzyska kuleczk osadu bakterii na dnie probwki. Taki osad nastpnie trzeba byo zawiesi w specjalnym agarze. Mieszanin bakterii i agaru umieszcza si w foremkach wielkoci draetek gumy do ucia i otrzymuje si co w rodzaju przeroczystych elek Haribo, zawierajcych cae komrki bakterii. Po co? Nic prostszego. Jeli chce si bada materia genetyczny (DNA−kwas dezoksyrybonukleinowy) czystego szczepu, naley unieruchomi cae komrki wanie w takiej elce. Uatwia to procedury „odzierania” DNA znajdujcego si we wntrzu komrki z oson i czyszczenia go z resztek komrkowych za pomoc serii puka w rnych zwizkach chemicznych. Otrzymujemy w ten sposb oczyszczony DNA unieruchomiony agaroz.
Jak wiadomo, DNA skada si z 4 rodzajw cegieek, ktre uoone w rnej kolejnoci tworz dugie nici. eby porwna, czy kolejno uoenia tych cegieek rni si w przypadku bakterii identycznych na pierwszy biochemiczno−mikrobiologiczny rzut oka, trzeba je poci enzymami restrykcyjnymi. Te enzymy, to nic innego, jak molekularne noyczki, ktre rozpoznaj okrelony tylko dla siebie ukad elementw skadowych DNA i przecinaj go w tym miejscu. Jeli DNA dwch bakterii rni si, enzymy potn go w rnych miejscach, poniewa rozpoznawana przez nie sekwencja bdzie zlokalizowana gdzie indziej (patrz rys.). Uzyskamy wtedy rnej wielkoci kawaki DNA. Tak elk, zawierajc pocity materia genetyczny, umieszcza si z kolei w duym kawaku elu agarozowego, a ten w aparacie wypenionym buforem, czyli ciecz utrzymujc stae warunki reakcji zwanej elektroforez. Jak sama nazwa wskazuje, reakcja zwizana jest z dziaaniem prdu. DNA, jako naadowane ujemnie, bdzie wdrowao w elu w kierunku elektrody dodatniej. Przeciskajc si przez struktury elu, poszczeglne kawaki pocitego DNA bd si od siebie oddziela, tworzc charakterystyczne dla szczepu wzory, porwnywane potem komputerowo. Nie uwierzycie, ale analizujc wzory DNA po elektroforezie znalelimy zupenie nowy biotyp!
Do Danii zawitaa pikna wiosna. By czerwiec, kiedy unoszc w ramionach raport z naszej mikrobiologicznej dziaalnoci jechaam do domu. Mogam tam zosta, ale zdecydowaam si wrci do Polski, poniewa tu jest moje miejsce. I miejsce mojej nauki.
W badaniach wszystko moe by naprawd proste, wystarczy w to uwierzy. Czsto sysz opinie, e za granic jest lepiej. W chwilach zwtpienia te zaczynam czasem tak myle. Ale przecie trawa jest zawsze bardziej zielona po drugiej stronie potu. A w kocu to od nas zaley, jak traw posiejemy w swoim ogrdku i jak bdziemy o ni dbali.