Białko określane jest często mianem molekuły życia. Nic więc dziwnego, że poznanie jej struktury jest nie lada wyzwaniem.

cenne Kryształy

Mariusz Karwowski

Doktor Grzegorz Dubin jest chyba w czepku urodzony. On sam woli unikać takich określeń, ale przyznaje, że coś jest na rzeczy. W ciągu minionego roku uśmiechu losu doświadczył nieraz. Dziesięć miesięcy temu po raz pierwszy poczuł, co to znaczy być ojcem. Urodziła mu się córka Dorotka. Mniej więcej w tym samym czasie na jego rodzimym Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego powstało Laboratorium Krystalizacji Białek. Powstało, to za mało powiedziane. To przecież też jego „dziecko”. Pilotował tę inicjatywę od samego początku. Chodził, składał wnioski, przekonywał, że to będzie strzał w dziesiątkę. Kiedy wreszcie dopiął swego, na efekty nie trzeba było długo czekać. Nie minął rok od powstania, a laboratorium już się może pochwalić pierwszymi znaczącymi osiągnięciami.

– Nie chcę być pyszny, ale wydaje mi się, że tak miało być. To chyba szczęście nowicjusza, bo rzeczywiście pierwsze białko, które samodzielnie tutaj zrobiłem, począwszy od prób krystalizacji aż do rozwiązania struktury, to był czas rzędu trzech miesięcy – nie kryje dumy.

NA CHYBIŁ TRAFIŁ

Kwartał to naprawdę niewiele. Zdarza się, że aby otrzymać kryształ, pracuje się rok, a czasem nawet dłużej. Wszystko po to, by potem opracować lek blokujący białko, które odpowiada za objawy konkretnej choroby. Ale wcześniej trzeba poznać strukturę tego białka. I temu właśnie służy krystalizacja. Nie jest to proces ani szybki, ani łatwy. Czasem właściwy kryształ powstaje dopiero po stu lub więcej próbach.

– To, co pan tu widzi, to jest jakieś tysiąc prób. I wszystkie tylko do jednego białka – Grzegorz Dubin otwiera szafkę i pokazuje sporej wielkości kolumnę plastikowych płytek. – Najwięcej zrobiłem chyba około półtora tysiąca. Można i jeszcze więcej, tyle że w pewnym momencie przekracza to już nasze zdolności. Jedno jest pewne: im więcej się przetestuje, tym większe prawdopodobieństwo trafienia na właściwy kryształ.

Nigdzie nie jest jednak powiedziane, że akurat się uda. Czasem i po tysiącu prób nic nie wychodzi. Wpływa na to wiele czynników. Przede wszystkim skład roztworu, w którym krystalizuje się dane białko. Nie ma żadnych teoretycznych przesłanek, jaki powinien być ten optymalny, więc testy opierają się na sprawdzonej metodzie… „na chybił trafił”. Oczywiście, można spróbować zastosować bufory, w których krystalizowane były wcześniejsze białka, ale nie zawsze to pomaga. Standardowych odczynników jest blisko pół setki. Trzeba jednak pamiętać, że mogą one występować w różnych stężeniach i kombinacjach. Już tylko z tych pięćdziesięciu można zrobić nieskończenie wiele połączeń. Drugim istotnym czynnikiem jest temperatura. Każdy roztwór testuje się podwójnie: najpierw w temperaturze pokojowej, czyli około 20−25 °C, a następnie znacznie niższej, tj. około 4 °C.

– Jeśli wszystko idzie zgodnie z założeniami, a badaczowi dopisuje szczęście, to kryształy będą tak właśnie wyglądały. – Mój rozmówca wyjmuje próbkę i pokazuje pod mikroskopem trójwymiarowe, dorodne okazy, przypominające wyglądem znacznie pomniejszoną… kostkę Rubika. – To jest ostateczny cel, do którego się dąży. Wiele z tych kryształów, które otrzymujemy w wyniku codziennych doświadczeń laboratoryjnych, jest dużo brzydszych i później trzeba je jeszcze optymalizować.

Prawdziwa loteria, nieprawdaż? Równie dobrze można otrzymać taki kryształ już na drugi dzień, jak i po pół roku. Albo, co gorsza, wcale. Kiedy jednak wysiłek zostanie zwieńczony sukcesem, następnym etapem są pomiary. Tu również nie jest łatwo. Nie dość, że kryształy są mikroskopijnych rozmiarów, to po krystalizacji pozostają mokre. Dlatego umieszczane są w specjalnych szklanych rurkach, aby nie wyschły. Rurkę z kryształem montuje się w dyfraktometrze. To ogromnych rozmiarów urządzenie „prześwietla” kryształ za pomocą promieni rentgenowskich. Za pomocą detektora powstaje elektroniczny zapis obrazów dyfrakcyjnych, czyli pośrednio atomów i połączeń między nimi, a obraz ten odczytywany jest na ekranie komputera.

– Im bardziej regularny i zwykle im większy kryształ, tym lepiej, bo wtedy silniej rozprasza promienie rtg, a dzięki temu można uzyskać większą rozdzielczość i zobaczyć niejako więcej tego, co jest w jego środku. Przy dobrych strukturach białek otrzymujemy rozdzielczość rzędu nawet 1 angstrema. Dla wyobrażenia, o jakie wielkości chodzi, powiem, że w angstremach wyrażamy wielkości atomów i ich odległości w cząsteczkach.

Białko, jak wiadomo, jest złożone z kilkudziesięciu aminokwasów, z których każdy składa się z masy atomów. W jednym białku daje to liczbę rzędu kilku tysięcy atomów. A w krysztale są niezliczone ilości cząsteczek białka. Zobaczenie ich wszystkich graniczyłoby z cudem. Jak zatem odczytać strukturę kryształu? Metoda samego pomiaru jest podobna do… prześwietlenia w pracowni rentgenowskiej. O ile jednak w przychodni dostajemy obraz wnętrza fragmentu naszego organizmu, o tyle tutaj można liczyć jedynie na masę punktów, jaśniejszych i ciemniejszych, które wbrew pozorom nie są pojedynczymi atomami. Dopiero przeliczenie ich intensywności i położenia względem siebie specjalnym programem komputerowym pozwala określić strukturę badanego białka. Dzięki niej wiadomo, jak białko wygląda oraz jak działa.

– Jeszcze do niedawna obliczenia takie sprawiały spore trudności. Teraz na dobrą sprawę można rozwiązać wiele struktur w ciągu kilku godzin i to na domowym komputerze. Kiedyś robiły to wyspecjalizowane centra obliczeniowe, które zajmowały kilka pomieszczeń. Postęp jest więc ogromny, a krystalizacja stała się już niemal rutynową metodą.

BĘDĄ TEŻ MROŻONE

Intensywność wiązki promieniowania w dyfraktometrze jest znacznie silniejsza niż w zwykłej lampie rentgenowskiej. To zaleta, bo można szybciej „prześwietlić” kryształ, ale i wada – pod wpływem promieniowania kryształ szybko się niszczy.

– Dlatego jeszcze w tym roku planuję zakup kriostatu, który w ramach programu NOVUM zdecydowała się dofinansować Fundacja na rzecz Nauki Polskiej. Jest to urządzenie, które dmucha zimnymi parami azotu na kryształ, dzięki czemu pozostaje on cały czas zamrożony, a przez to dużo trwalszy niż podczas pomiarów w kapilarach – wyjaśnia dr Dubin.

Z dyfraktometrem są też i inne problemy, których nie da się uniknąć. Tylko to jedno urządzenie wytwarza moc średniej wielkości budynku mieszkalnego. Pobór prądu jest więc ogromny. Blisko miesiąc trwało skonstruowanie specjalnej linii, aby na wydziale przy włączaniu dyfraktometru nie było problemów z prądem. W dodatku wydziela on ogromne ilości ciepła, które trzeba jakoś odprowadzić. Głowica non stop chłodzona jest zimną wodą, w innym przypadku szybko by się stopiła. Aż dziw bierze, że to gigantyczne urządzenie służy do zmierzenia mikroskopijnych rozmiarów kryształu. Dyfraktometr z niepozornego laboratorium czyni nowoczesne centrum biotechnologii.

– Naprawdę dużo pracy włożyłem w to, żeby laboratorium wyglądało tak, jak wygląda. Na taką skalę działalności, jaką obecnie prowadzę, jest ono już z całą pewnością wystarczające. Wyniki, które otrzymuję, jestem w stanie sam opracować. Gorzej jest z produkcją białek, bo to dość chimeryczna rzecz. W to zaangażowanych jest sześć innych osób – wylicza stypendysta programu FNP, wspierającego młodych naukowców.

Laboratorium niewielkie, zespół też nieliczny, tymczasem sukcesy już są. Udało się bowiem rozwiązać struktury dwóch białek – proteinaz serynowych gronkowca. Badania finansowane były m.in. ze środków Unii Europejskiej. Jak się okazuje, nawet gronkowiec może być wdzięcznym tematem badawczym. Mój rozmówca zajmuje się nim już od kilku lat, więc niejako naturalną stała się kontynuacja tych zainteresowań w stworzonym przez niego od podstaw Laboratorium Krystalizacji Białek. Wcześniej przebywał na zagranicznym stażu w Niemczech, w Instytucie Maxa Plancka (MPI).

– Tam też zajmowałem się krystalizacją. Różnica jest taka, że dookoła mnie było dziesięciu innych krystalografów i zawsze można było zwrócić się do nich o pomoc. Tutaj musiałem już sam borykać się z wszelakimi problemami, choć nie mogę nie wspomnieć o życzliwej pomocy naukowców z MPI, udzielanej mi w kluczowych momentach. Całe szczęście, udało się przez to wszystko przebrnąć bez większych kłopotów. Satysfakcja więc podwójna – nie kryje zadowolenia.

wśród 40 TYSIĘCY

Gronkowiec produkuje różne białka, z których część jest czynnikami wirulencji tej bakterii, czyli jest odpowiedzialna za to, że powoduje ona choroby. Patogen ten produkuje całą gamę proteinaz, m.in. te dwie, których strukturę rozwiązano w Krakowie i uważa się, że należą one właśnie do tej szerokiej gamy czynników wirulencji gronkowca. Czyżby oznaczało to prostą drogę do opracowania leku? Oczywiście, można by tak powiedzieć, ale byłaby to… czysta demagogia.

– Problem polega na tym, że wiele bakterii, których mechanizmy patogenezy udało się już rozpracować, bazowało na pojedynczym czynniku wirulencji. Tak było np. z wąglikiem, gdzie za śmiertelny efekt bakterii odpowiedzialne jest pojedyncze białko. Kiedy zahamujemy jego aktywność, bakteria staje się niegroźna.

U gronkowca natomiast nie występuje pojedyncze białko odpowiedzialne za wirulencję. Jest ich kilkadziesiąt i to różnych. O leku hamującym je wszystkie nie ma nawet mowy.

– Gronkowiec produkuje kilkadziesiąt białek zewnątrzkomórkowych i nie wiemy, które z nich są absolutnie konieczne do tego, żeby był wirulentny. Gdybyśmy byli w stanie wskazać chociaż pięć z nich, ważniejszych od pozostałych, to już byłby sukces, ale jeszcze za mało wiemy na temat tych białek w ogóle.

A gdyby tak poznać strukturę tych pozostałych? – prowokuję.

– O, i to jest bardziej celem tego, co robię, niż stworzenie leku. Ale to jeszcze potrwa. Na razie nie znamy nawet połowy z nich.

Mimo to, dr Dubin liczy na współpracę z przemysłem farmaceutycznym. Tym bardziej że współczesne leki oparte są na wiedzy dotyczącej struktury białek. A krystalografia jest w zasadzie jedyną metodą jej poznawania. Przy tym najbardziej wydajną i wszechstronną. Może więc z powodzeniem wspomagać proces tworzenia leku.

– Taka współpraca to jest coś, co mi się marzy. Prowadzę już rozmowy z jedną dużą firmą. Gdyby kiedyś nasze badania przyczyniły się do powstania nowego leku, będzie to znaczyło, że warto było, już choćby tylko dla samej satysfakcji. Poza tym cały czas ulepsza się istniejące leki. Jeśli chodzi np. o AIDS, to ciągle jest to nieuleczalna choroba, ale między innymi dzięki krystalizacji jesteśmy już w stanie zahamować jej postęp. Farmacja stanowi więc swego rodzaju wyzwanie dla krystalografii.

Rozwiązywane struktury białkowe deponowane są w ogólnodostępnej światowej bazie Protein Data Bank (PDB). Krakowski naukowiec umieścił tam też dwie swoje. W sumie jest ich już ponad 40 tysięcy. To bardzo dużo w porównaniu z tym, co było jeszcze choćby dekadę temu, ale ciągle niewiele wobec tego, co pozostaje nieznane. Przed krystalografami wciąż więc wiele pracy.

– Bardzo często w nauce jest tak, że cel pojawia się dopiero wówczas, gdy się gromadzi coraz większą ilość danych. Proteinazy, które krystalizowałem w laboratorium, okazały się być bardzo dobrymi enzymami do przeprowadzania jednego z procesów w technologii produkcji białek rekombinatowych, używanych w przemyśle biotechnologicznym. Mówiąc najprościej, sam proces nie jest lekiem, ale może być jednym z narzędzi do stworzenia leku. I to było coś zupełnie zaskakującego, nie dało się tego przewidzieć wcześniej. Przeprowadziłem już większość doświadczeń, które pokazują, że można tak zastosować charakteryzowane przeze mnie enzymy. I ten kierunek badań będę rozwijał. – Dr Grzegorz Dubin nie kryje, że liczy na podtrzymanie dobrej passy. W końcu mijający rok okazał się niezwykle owocny.

Najnowszy numere-wydanie

Błąd 404 - Strona o podanym adresie nie istnieje

   Wróć na stronę główną