Bukiet wina czy perfum stanowi o wyjątkowości konkretnego gatunku bądź marki. Ale charakterystyczne cechy mają również bukiety… chorobowe.

Badania wyjątkowo aromatyczne

Mariusz Karwowski

Prof. Bogusław Buszewski przy chromatografie

Testuję kapnograf

Podobno ten, kto ma władzę nad zapachami, ma władzę nad sercami ludzi. Wyznający tę zasadę bohater Pachnidła Patricka Süskinda wiedział, że ludzie mogą zamykać oczy na grozę, piękno, mogą zamykać uszy na melodie albo bałamutne słowa. Ale przed zapachem uciec nie zdołają. Prof. Bogusław Buszewski z Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, chociażby z racji zawodowych pasji, zmysłowe dzieło niemieckiego pisarza obowiązkowo przeczytał, ale daleki jest od porównywania swoich badań z tą, bądź co bądź, literacką fikcją. Podstawowa różnica – tam szukano całkiem nowych zapachów i dla osiągnięcia tego celu nie cofano się nawet przed zbrodnią, w Toruniu natomiast, oględnie rzecz ujmując, opisuje się je i kataloguje, a wystarcza do tego oddech pacjenta. Mimo tych różnic, jest coś, co łączy. Zarówno otwierając książkę, jak i drzwi do laboratoriów Katedry Chemii Środowiska i Bioanalityki Wydziału Chemii UMK, wkraczamy w fascynujący świat, w którym można zobaczyć to, co niewidzialne. I choć w tym drugim przypadku w dużej mierze pomagają skomplikowane technologie, nowoczesne urządzenia, to tak jak w XVIII−wiecznym Paryżu, bez genialnego węchu się nie obędzie.

– Identyfikacja wszelkiego rodzaju zapachów służy nam do diagnozy różnych chorób. Diagnozy rozumianej jako profilaktyka, czyli badania przyczynowe. Chodzi o to, żeby można było wcześnie wykryć początkowe stadium choroby – wyjaśnia szef katedry.

I dodaje, że kluczowa w tym względzie jest umiejętność rozróżniania w sposób selektywny i oznaczania w sposób ilościowy substancji tworzących bukiet danej jednostki chorobowej. Cukrzycę można rozpoznać przecież po woni acetonu, podobnej do woni zgniłych jabłek, chorą wątrobę sygnalizuje zapach stęchlizny, a więc związków siarki, u gruźlików z kolei oddech pachnie nieświeżym piwem, a nieprzyjemny aromat surowego mięsa pojawia się u chorych na febrę.

W Toruniu próbują znaleźć swoisty kod zapachowy nowotworów płuc i układu pokarmowego, ale także prostaty i szyjki macicy. Badania prowadzone są niejako dwutorowo. W laboratoriach Katedry Chemii Środowiska i Bioanalityki pobiera się próbki powietrza, zarówno od zdrowych, jak i chorych, palących i niepalących. Klinika Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Onkologicznej Collegium Medicum dostarcza materiał w postaci tkanek od osób, które poddawane są zabiegom. Wiadomo, że bakterie obecne w materiale biologicznym wydzielają szereg lotnych związków organicznych, więc porównuje się wydzielane przez nie substancje z oddechem człowieka. Wyselekcjonowane w ten sposób związki tworzą mapę zapachową. Oddech pobiera się kilkakrotnie i jeśli związki w nim obecne występują również w oddechu zdrowych osób z grupy kontrolnej, wówczas uznaje się, że te substancje nie mają większego znaczenia. Bywa jednak i tak, że znajdują się one tylko u chorego, a wtedy oznacza to, że mogą być specyficzne dla nowotworu. Wówczas należy je zidentyfikować i określić ilość. Jest to pierwszy etap badań, który pozwala na wstępną weryfikację rezultatów.

Zresztą, wiele zapachów może pochodzić nie tylko z oddechu, ale i… skóry. W Stanach Zjednoczonych robiono badania, w których selekcjonowano gazy wydzielane z czerniaka. Znany jest przypadek psa, który podczas jednej z wystaw zaczął się nienaturalnie zachowywać, pokładając się u stóp jednej z jurorek. Zwierzę zareagowało na specyficzną kompozycję lotnych substancji wydzielanych przez komórki czerniaka. Później wyszło na jaw, że kobieta rzeczywiście była chora na raka skóry.

ZAPACH ŻUŻLA

Niełatwo znaleźć substancje charakterystyczne dla danej choroby. W końcu szuka się trzech, może czterech z całego zestawu liczącego około tysiąca. Takie trafienie to dopiero sztuka. To art of science, jak określa mój rozmówca.

– Naszym celem jest znalezienie markera, dzięki któremu będzie można rozróżnić substancje wydzielane przez chore komórki. Będziemy wówczas wiedzieli, ile ich jest i z jakim typem nowotworu mamy do czynienia. Każdy ma bowiem jakieś specyficzne cechy. To tak, jak z motocyklem szosowym i żużlowym. Niby podobne, oba służą do przemieszczania się, a jednak się różnią – obrazowo tłumaczy prof. Buszewski, nie dając zapomnieć, że jesteśmy w Toruniu, stolicy polskiego żużla. W tym sporcie, zwłaszcza przy pierwszym z nim zetknięciu, zapach też odgrywa niebagatelną rolę. Intensywna woń spalin podczas pracy silnika potrafi wielu przyciągnąć, ale i skutecznie zrazić. W grodzie Kopernika raczej to pierwsze. Speedway, obok pierników i astronomów, jest chyba najlepszym towarem eksportowym Torunia. Wkrótce może się nim stać także metoda zapachowej diagnozy chorób. Jej niewątpliwą zaletą jest nie tylko szybkość, wszak wynik można otrzymać już w ciągu godziny, ale i to, że odbywa się bezinwazyjnie.

– Takich urządzeń badawczych nigdzie nie zobaczy pan w jednym miejscu, nawet w USA. Prof. Buszewski wprowadza mnie do laboratorium, w którym aż roi się od różnego rodzaju aparatury. Czego tam nie ma! Chromatografy gazowe i cieczowe, spektrometry… Moją uwagę przykuwa stojący na stole kapnograf, który, jak się okazuje, służy do pomiaru stężenia ditlenku węgla w oddechu.

To niewielkie urządzenie zaopatrzone jest w worek, który w momencie oddechu wypełnia się powietrzem, zawierającym lotne związki organiczne. W kolejnym etapie wszystkie lotne związki trafiają na specjalny kwarcowy pręcik z sorbentem w formie nanofilmu, gdzie następuje ich sorpcja. Po włożeniu do chromatografu gazowego, pod wpływem wysokiej temperatury, następuje uwolnienie związków i wprowadzenie do kolumny, gdzie rozdzielają się na poszczególne substancje składowe. Efektem całego procesu jest chromatogram, w którym każdy pik oznacza inny związek chemiczny. Jednocześnie spektrometr mas generuje widma każdej substancji znajdującej się w próbce. Korzystając z bogatej biblioteki związków komputer automatycznie przypisuje strukturę do właściwej substancji, dokonując wstępnej identyfikacji. Następnie każdy chromatogram oraz widmo nieznanego związku są porównywane z substancją wzorcową. Przeważnie są to ketony, aldehydy, węglowodory proste. To one decydują najczęściej o „aromacie” charakterystycznym dla konkretnej choroby.

– Pojedynczy pik, dobrze rozdzielony, informuje nas, co to za substancja, a na podstawie powierzchni pod krzywą mogę powiedzieć, ile tego związku się tam znajduje, a co za tym idzie – na jakim etapie jest rozwój ewentualnej choroby. Im bardziej precyzyjna metoda, tym wartość odchyleń będzie mniejsza, dlatego tak istotna jest jej kalibracja. Od jednego pacjenta pobieramy kilka próbek, zdarza się, że nawet i siedem, po to, aby uwiarygodnić badanie. To naprawdę benedyktyńska praca – przyznaje prof. Buszewski.

W badaniach wykorzystuje się także automatyczne urządzenie do pobierania próbek powietrza (Breath Sammler). Ten aparat działa na podobnej zasadzie co kapnograf, z tym że automatycznie chwyta próbkę powietrza ze strumienia oddechu i pobiera jedynie powietrze pęcherzykowe (alweolarne). Urządzenia służące do badań są tak czułe, że już śladowe ilości substancji zawartych w wydychanym powietrzu mogą pozwolić na ich identyfikację. Przygotowanie próbek odgrywa więc istotną rolę i musi być niezwykle precyzyjne, bo ten swoisty monitoring odbywa się na poziomie molekularnym. To tak, jakby wyłowić kroplę wody z basenu o wymiarach olimpijskich. A przecież oprócz mikroorganizmów na zapach może wpłynąć również… dieta żywieniowa. I ją także trzeba wziąć pod uwagę. Dzięki tym wszystkim czynnikom skuteczność metod instrumentalnych w wykrywaniu zapachów dochodzi nawet do 85 proc., czyli dwukrotnie więcej niż u zwierząt, które potrafią rozróżnić zapach jedynie w około 40 proc. W przyszłości może to oznaczać przełom w medycynie czy kryminalistyce.

– Żeby się upewnić, będziemy chcieli porównać naturalny nos psa z chromatografem i naszym urządzeniem. W tym celu nawiązaliśmy współpracę z prof. Tadeuszem Jezierskim z Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu, który zajmuje się wykorzystywaniem psów w diagnostyce chorób.

Identyfikacja lotnych związków organicznych to jedno, ale za pomocą technik elektromigracyjnych można również rozdzielić kultury bakteryjne i prowadzić dalsze obserwacje, które dadzą odpowiedź na pytania, jaki wpływ mają te bakterie i czy komórka rakowa uwalnia jakieś związki. Tak właśnie się dzieje choćby z Helicobacter pylori, która przyczynia się do powstawania raka. Po rozdzieleniu i wyizolowaniu tych patogennych mikroorganizmów, uzyskuje się materiał referencyjny, mogący być tłem oddechu pacjenta. Taka wyhodowana, czysta kultura bakteryjna stanowi jakby bioreaktor, w którym zbierać się będą gazy i pozwoli to na sprawdzenie, co się z niej wydziela. Oddech, chora tkanka i substancje wydzielane przez bakterie dadzą pełen obraz organizmu pacjenta. I to właśnie będzie zapach choroby.

CO, ILE, JAK, DLACZEGO?

W trakcie trzyletnich badań prof. Buszewski wraz z zespołem rozpoznał setki potencjalnych substancji, z czego wyselekcjonowano kilkanaście, które dobrze „rokują na przyszłość”. Efekty przeszły najśmielsze oczekiwania.

– Na początku trudno się było spodziewać, że aż tak daleko zabrniemy, bo jednak nie myśleliśmy nigdy o sztucznym nosie czy o układzie, który by go symulował.

Zanim jednak nastąpi transfer tej metody do praktyki, musi upłynąć jeszcze trochę czasu. Mój rozmówca podkreśla to z całą mocą, gdyż nie chciałby już dziś, teraz, dawać chorym nadziei. Owszem, jest zafascynowany postępem prac, rezultatami, ale nie przesłania mu to podstawowej cechy naukowca, czyli odpowiedzialności. Jak sportowiec zażywający niedozwolone anaboliki kończy w niesławie karierę, zostaje pozbawiony zawodu, tak samo i tutaj – dostaje się wyrok i koniec. Można więc dać komuś nadzieję, ale i ją odebrać.

– Wydaje się, że złapaliśmy Pana Boga za nogi, ale musimy to jeszcze zinterpretować. Chemia, którą się zajmuję, odpowiada na podstawowe pytania: co, ile, jak? Sam zadaję sobie jeszcze czwarte: dlaczego? Bo nie można postawić diagnozy, póki nie pozna się całego mechanizmu, tak żeby można było przeciwdziałać.

Badania prowadzone są w ramach projektu BAMOD (Breath−gas Analysis for Molecular−Oriented Detection of Minimal Diseases). Na jego realizację Komisja Europejska przeznaczyła 3 mln euro. Uczestniczą w nim naukowcy z Austrii, Słowacji, Czech, Anglii, Polski i Niemiec. W sumie 16 zespołów. Zdaniem prof. Buszewskiego, koordynującego polską część, sukces projektu tkwi w tym, że spotkali się ludzie mający do siebie pełne zaufanie, w żadnym stopniu niekonkurujący ze sobą. Nikt nie jest tu od nikogo lepszy ani gorszy. Wspomina, że gdy przed 15 laty przyjechał do grodu Kopernika i zaczął mówić o chromatografii, patrzono na niego z politowaniem, a niektórzy pukali się znacząco w czoło. Dziś to on triumfuje.

– Jesteśmy coraz bliżej powołania Centrum Edukacyjno−Badawczego Metod Separacyjnych i Bioanalitycznych BioSep. Będzie to jednostka, która wdroży i rozszerzy na większą skalę wszystko to, co teraz robimy. Prowadzimy przecież badania interdyscyplinarne z udziałem mikrobiologów, genetyków, toksykologów, fizyków, immunochemików, immunobiologów, onkologów... Interesuje nas opracowanie układów selektywnych, dzięki którym można byłoby rozróżniać całe szczepy bakterii, wirusów, np. grypy, sepsy, salmonelli... Są już wprawdzie takie metody, stosowane choćby w testach alergicznych czy na HIV, ale one trwają zbyt długo – mówi prof. Buszewski, który przez trzy lata był stypendystą fundacji Humboldta w Uniwersytecie w Tybindze. Później przeniósł się na Kent State University w Ohio.

Kiedy pytam go o powrót do Polski i przenosiny z Lublina, gdzie narodziły się jego pasje naukowe, do Torunia właśnie, odpowiada bez wahania, że z perspektywy czasu jednak nie żałuje. To prawda, wówczas nie chciał wracać, sądził, że to będzie krok w tył. Tym bardziej że to, co robił w Ameryce, tutaj nikogo specjalnie nie interesowało. Ale się nie ugiął. Odziedziczony po dziadku twardy, kresowy charakter pozwolił wytrwale, uparcie realizować cel. Zresztą profesor dalej to czyni, z satysfakcją, ale i uznaniem podkreślając ogromne wsparcie żony oraz zespołu swoich współpracowników−wychowanków. Cóż, może rzeczywiście, ten kto ma władzę nad zapachami, ma władzę nad sercami ludzi…