Innowacyjne barwniki, do zastosowania m.in. w mikroskopii fluorescencyjnej, bardzo silnie emitujące światło czerwone, a zatem potencjalnie umożliwiające badanie głębiej położonych struktur biologicznych, opracował zespół naukowców z Instytutu Chemii Organicznej PAN w Warszawie.
Jak tłumaczy kierujący badaniami prof. Daniel T. Gryko, fluorescencja to zdolność do emitowania światła o określonym kolorze, na skutek wzbudzenia promieniowaniem świetlnym o określonej długości. Związki wykazujące fluorescencję są przez ludzi wysoko cenione i szeroko wykorzystywane. Z ich specyficznych właściwości korzystamy, używając np. fluorescencyjnych zakreślaczy, a także tabletów, laptopów czy telewizorów z wyświetlaczami zbudowanymi z tzw. OLED-ów, czyli diod na bazie związków organicznych, emitujących światło niebieskie, zielone i czerwone. Związki cechujące się fluorescencją znalazły też zastosowanie w nowoczesnej biologii molekularnej i diagnostyce medycznej. Wykorzystuje się je do obserwacji – przy pomocy mikroskopów fluorescencyjnych – różnych organelli komórkowych, białek, a także do śledzenia procesów zachodzących w komórkach.
Mikroskop fluorescencyjny ma ogromną przewagę nad konwencjonalnym pod względem rozdzielczości. Z uwagi na falową naturę światła, mikroskop optyczny nie pozwala na obrazowanie struktur mniejszych niż około 200 nanometrów. Rozdzielczość o kilka rzędów wielkości większą ma mikroskop elektronowy, ale można w nim obserwować wyłącznie martwe obiekty, umieszczone w próżni i bombardowane wiązką elektronów. Za pomocą mikroskopii elektronowej nie można badać żywych organizmów ani naturalnie zachodzących w nich procesów. Rozwiązaniem jest mikroskop fluorescencyjny. Do przeprowadzenia obserwacji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego niezbędne są cząsteczki posiadające zdolność fluorescencji, nazywane barwnikami lub znacznikami. Dołącza się je do obiektu, który ma być uwidoczniony pod mikroskopem, np. konkretnego białka, i w ten sposób można obserwować np. specyficzne przeciwciała lub białka biorące udział w rozwoju chorób uszkadzających mózg: w chorobie Parkinsona, Alzheimera czy Huntingtona. Najbardziej zaawansowaną techniką mikroskopii fluorescencyjnej jest mikroskopia typu STED (Stimulated Emission Depletion), w której oprócz wiązki światła wzbudzającego, wykorzystuje się dodatkową wiązkę, która wygasza fluorescencję na brzegach wzbudzonego punktu. Dzięki temu uzyskany obraz ma bardzo wysoką rozdzielczość. Opracowanie mikroskopii fluorescencyjnej typu STED zostało uhonorowane Nagrodą Nobla w 2014 roku. Dzięki niej możliwe stało się precyzyjne badanie m.in. wzajemnych oddziaływań białek w komórkach czy różnicowania się tkanek w rozwoju embrionalnym.
Barwniki fluorescencyjne przeznaczone do stosowania w mikroskopii STED muszą posiadać – oprócz fluorescencji – kilka innych istotnych cech, np. możliwość penetracji przez błony komórkowe żywych komórek oraz dużą fotostabilność. Z tą ostatnią właściwością często jest spory problem, ponieważ wiele ze związków rozpada się pod wpływem światła laserowego o dużej mocy, które jest używane w mikroskopie fluorescencyjnym.
– Zaprojektowanie, a następnie zsyntetyzowanie lepszych barwników pozwoli na dalszy rozwój mikroskopii STED oraz w przyszłości na jej użycie w diagnostyce medycznej – przekonuje prof. Daniel Gryko, któremu właśnie udało się to osiągnąć. Zespół pracujący pod jego kierownictwem, we współpracy z naukowcami z Francji i Niemiec, stworzył nową klasę trwałych znaczników fluorescencyjnych – nowy typ diketopirolopiroli – wykazujących niezwykle intensywną emisję światła czerwonego.
– Silna czerwona fluorescencja stwarza szansę na zastosowanie tych związków organicznych jako sond fluorescencyjnych, ponieważ właśnie ten kolor światła jest najlepiej widoczny pod mikroskopem fluorescencyjnym – podkreśla prof. Gryko.
Osiągnięcie to zostało opisane w artykule pt. „How to Make Nitroaromatics Glow: Next Generation Large, χ—Shaped, Centrosymmetric Diketopyrrolopyrroles”, który ukazał się w jednym z najbardziej renomowanych czasopism naukowych – Angewandte Chemie. Jego pierwszym autorem jest dr Kamil Skonieczny. Publikacja ta tłumaczy także dlaczego diketopirolopirole posiadają silną fluorescencję, pomimo posiadania w swojej strukturze dwóch grup nitrowych. Dotychczas naukowcy uważali, że grupa nitrowa prawie zawsze tłumi fluorescencję, a zatem związki ją posiadające, z jednym wyjątkiem, nie służą jako znaczniki fluorescencyjne. Badacze wykazali, że przy spełnieniu odpowiednich założeń grupa nitrowa nie wpływa na fluorescencję związku, co jest o tyle istotne, że często podwyższa ona stabilność znacznika. Warto dodać, że odkrycie to jest w trakcie patentowania.
Syntezy nowych znaczników i wyjaśnienia mechanizmu świecenia tych związków dokonano w toku prac naukowych, prowadzonych w ramach grantu TEAM 3/2016, finansowanego przez Fundację na rzecz Nauki Polskiej ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Inteligentny Rozwój.
Prof. Daniel Gryko jest dyrektorem Instytutu Chemii Organicznej PAN. Do jego najważniejszych zainteresowań naukowych należy chemia barwników funkcjonalnych, a w szczególności koroli, czyli barwników makrocyklicznych o licznych zastosowaniach. Jest laureatem subsydium profesorskiego MISTRZ Fundacji na rzecz Nauki Polskiej (2013). Dwukrotnie zdobył też grant w programie TEAM FNP. W 2017 r. został uhonorowany Nagrodą Fundacji na rzecz Nauki Polskiej, uznawaną za najważniejsze polskie wyróżnienie naukowe.
źródło: FNP