Nad nowymi kompozycjami hydrożelowymi, które umożliwią biodruk 3D tkanek miękkich na dużą skalę, pracuje badaczka z Centrum Zaawansowanych Technologii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Na realizację tego projektu otrzymała blisko 3,5 mln zł z Fundacji na rzecz Nauki Polskiej.
Do niedawna wytwarzanie spersonalizowanych tkanek czy organów, takich jak wątroba, płuca, nerki, pozostawało w sferze marzeń. Wszystko zmieniło się za sprawą biodruku 3D, który takie możliwości potencjalnie oferuje. W tej technologii – w przeciwieństwie do druku 3D, gdzie używa się materiałów opartych na tworzywach sztucznych, np. plastiku – wykorzystuje się żywe komórki, które zawieszone są w specjalnym hydrożelowym biomateriale. Warstwa po warstwie tworzone są z nich skomplikowane trójwymiarowe struktury i kształty formujące tkanki.
Naszą pracę można porównać do wyczynów kucharza przygotowującego tort, przy czym każde z jego pięter może być wykonane z innego materiału i mieć odmienny kształt. My także budujemy takie złożone konstrukty, tyle że przy pomocy opracowywanych przez nas biotuszy – wyjaśnia dr Jagoda Litowczenko-Cybulska z UAM, która wraz z zespołem tworzy nową linię skoncentrowaną na biodruku 3D.
Podobne do galaretki
Biotusze to hydrożele, które muszą posiadać konkretne parametry. Nie mogą być np. toksyczne w stosunku do komórek. Istnieje wiele odmian biodruku 3D, większość z nich wymaga biotuszy o odpowiedniej lepkości. Chodzi o to, aby zapewnić wysoką rozdzielczość druku oraz zachowanie pożądanego kształtu wydrukowanego konstruktu. Hydrożele wykorzystywane do biodruku 3D można porównać do galaretki żelatynowej. Żelatyna po rozpuszczeniu w ciepłej wodzie i schłodzeniu zastyga, tworząc sztywną strukturę. Jeśli jednak taką masę ponownie się podgrzeje, to ona z powrotem się rozpuści, a utworzonona forma zostanie zniszczona. Podobnie jest z hydrożelami stosowanymi w biodruku 3D. Z tą różnicą, że aby uzyskać trwały i stabilny wydruk, konieczne jest również odpowiednie usieciowanie hydrożelu, czyli wytworzenie połączeń makrocząsteczek w trójwymiarową sieć, aby struktura stała się stabilna i odporna na zmiany temperatury.
Usieciowane hydrożele są nierozpuszczalne, charakteryzują się także ograniczonym pęcznieniem. Nie rozpuszczą się nawet wtedy, gdy będziemy hodować wydrukowaną strukturę w inkubatorze, gdzie panuje temperatura zbliżona do temperatury ludzkiego ciała. Dzięki temu wydrukowany konstrukt, czyli trójwymiarowa struktura formująca tkankę, może rozwijać się w kontrolowanych warunkach, nie tracąc swojej integralności. Właśnie dlatego naukowcy muszą tak modyfikować wyhodowany materiał, by jego parametry pozwalały na efektywną pracę. Proces ten jest niezwykle istotny, ponieważ stabilność konstruktu umożliwia długotrwałą hodowlę komórek i tworzenie funkcjonalnych tkanek, które mogą znaleźć zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.
Pracujemy na hydrożelu, czyli materiale, który jest półpłynny lub w formie żelu – wyjaśnia dr Litowczenko-Cybulska. – Kiedy więc próbujemy stworzyć trójwymiarowy konstrukt zdarza się, że zapada się on pod ciężarem kolejnych warstw. Dlatego naukowcy z wykorzystaniem biodruku 3D wytwarzają zazwyczaj niewielkie kratki z jednej lub kilku warstw filamentów hydrożelu. Zdarza się też, że nie mogą sobie pozwolić na wydrukowanie większego konstruktu, bo nie dysponują wystarczającą ilością komórek, które wykorzystywane są do zawieszenia w hydrożelu. Często bywa i tak, że korzystają z komercyjnie dostępnych hydrożeli do biodruku 3D, które są kosztowne, a biodruk 3D skomplikowanych struktur przypominających tkanki jest trudny technologicznie do uzyskania. Z tych powodów wielu badaczy pozostaje przy drukowaniu kratki – dodaje.
Tubki niczym naczynia krwionośne
Badaczka z Centrum Zaawansowanych Technologii UAM podjęła to ryzyko i opracowała materiał, który umożliwia wydajny biodruk 3D kilkucentymetrowych, pustych w środku elastycznych tubek. Każda z tworzących je warstw wypełniona jest innymi typami komórek. Tubki mają na celu imitację naczyń krwionośnych. Są rozciągliwe podobnie jak naturalne żyły. Warto dodać, że dr Litowczenko-Cybulska zajmuje się także biodrukiem 3D hydrożeli zawierających komórki uzyskane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technologię ich pozyskiwania i różnicowania w komórki docelowe, takie jak fibroblasty serca, kardiomiocyty i komórki śródbłonka poznała w trakcie projektu Marie Curie Individual Fellowship, którym kierowała w Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL) w Barcelonie, współpracując równocześnie z University College London. Obecnie udoskonala technologię biodruku 3D konstruktów naczyniowych w CZT UAM.
Konstruktów tkankowych nie można hodować w tradycyjnie wykorzystywanych naczyniach używanych powszechnie w laboratoriach. Tubki otrzymywane przez badaczkę są po prostu na to zbyt duże. Dlatego hoduje się je w specjalnym bioreaktorze, który jest połączony z pompą perystaltyczną. Pozwala ona na wprowadzenie cieczy imitującej krew, co symuluje warunki panujące w żyłach. Taki system ciągłego przepływu płynu pozwala na sprawdzenie wytrzymałości tubek. Chodzi o to, aby upewnić się, się, że nie pękną i wszystkie komórki wewnątrz nich funkcjonują prawidłowo, zwłaszcza komórki śródbłonka. Biodrukowane naczynie krwionośne musi być stabilne, elastyczne i odporne na przepływ krwi pod wysokim ciśnieniem. W przyszłości tubki mogą potencjalnie być stosowane jako naczynia krwionośne tworzone w technologii inżynierii tkankowej, dlatego kluczowe jest, aby nie dopuścić do ich pęknięcia po wszczepieniu do organizmu. To nie wszystko, o czym należy pamiętać.
Wyobraźmy sobie, że wpuszczamy do dyszy drukarki hydrożel z zawieszonymi w środku komórkami i potem warstwa po warstwie drukujemy odpowiedni kształt w strukturze 3D. Nie możemy zapomnieć, że w tym procesie nasze działanie stanowi stres dla komórek. Nie dość bowiem, że używamy siły, aby je wydrukować, to jeszcze przez dłuższy czas trzymamy je w temperaturze pokojowej, czego one nie tolerują. Efektem jest ich obumieranie – zauważa badaczka.
Po każdym takim procesie należy sprawdzić, czy komórki zachowały żywotność, monitorując również ich morfologię wewnątrz konstruktów. Dotyczy to zwłaszcza szczególnie delikatnych komórek, na przykład kardiomiocytów. One wyjątkowo źle znoszą duże ciśnienie albo długą ekspozycję na promieniowanie, które wykorzystywane bywa do sieciowania hydrożeli. Nie przepadają też, kiedy za długo trzyma się je poza środowiskiem, w którym panuje odpowiednia temperatura i wilgotność.
Kardiomocyty są fascynujące. Kiedy obserwujemy je pod mikroskopem, zauważymy pulsujące komórki. Ten rytmiczny skurcz wyspecjalizowanych komórek mięśnia sercowego jest charakterystyczny tylko dla nich, więc kardiomiocytów nie da się pomylić z żadnymi innymi komórkami. Z uwagi na ich wrażliwość w hodowli, trzeba jak najbardziej skrócić czas biodrukowania, aby zminimalizować okres, w którym przebywają w niekorzystnych dla siebie warunkach – przekonuje dr Jagoda Litowczenko-Cybulska.
Aby ograniczyć problemy związane z wytłaczaniem w biodruku, naukowcy stosują także techniki biodruku 3D oparte na świetle. Metody te polegają na selektywnym sieciowaniu fotopolimerowych hydrożeli warstwa po warstwie, zazwyczaj przy użyciu światła UV. Niestety, z uwagi na to, że proces ten odbywa się w taki właśnie sposób, nie jest on odpowiedni dla wrażliwych typów komórek.
Przełomowy biodruk 3D
Najnowszy projekt badaczki ma być odpowiedzią na te ograniczenia. Otrzymała na ten cel prawie 3,5 mln zł w konkursie First Team FENG organizowanym przez Fundację na rzecz Nauki Polskiej. Ze środków tych zostanie zakupiona pierwsza, nie tylko w Polsce, ale w całej Europie Środkowo-Wschodniej, wolumetryczna biodrukarka 3D. To przełom, który zagwarantuje komórkom lepsze warunki wzrostu.
Stosunkowo nowa strategia wolumetrycznego biodruku pozwala na tworzenie dużych struktur tkankowych w ciągu zaledwie kilku sekund. Jej zaletą jest znaczne przyspieszenie procesu biodruku opartego na projekcji światła – podkreśla badaczka z UAM.
W tym procesie zawierająca hydrożel wirująca fiolka, przypominająca kształtem lampkę do wina, jest precyzyjnie naświetlana promieniowaniem laserowym. W miejscach, gdzie wiązka lasera trafia w materiał, światłoczuły żel ulega natychmiastowemu utwardzeniu. Dzięki technologii laserowej rekonstrukcji 3D możliwe jest szybkie tworzenie złożonych struktur o wielkości nawet kilku centymetrów w zaledwie kilka sekund. Co najważniejsze, krótki czas ekspozycji na światło minimalizuje stresujące warunki dla komórek, dzięki czemu nie ulegają one uszkodzeniom, na które są narażone przy obecnej technologii. Oprócz samej technologii ważny jest także materiał.
W mojej grupie badawczej opracowujemy unikatowy materiał oparty na fibroinie jedwabiu – to białko występujące w jedwabiu produkowanym przez udomowione jedwabniki morwowe. Jego zaletą jest duża wytrzymałość i elastyczność. Opracujemy dwuskładnikowy biotusz, który będzie zwiększał unaczynienie konstruktów drukowanych 3D – zapowiada badaczka.
Obecnie w laboratoriach zajmujących się biodrukiem 3D używa się w biodruku jednego typu komórek, na przykład fibroblastów albo wspomnianych już kardiomiocytów. Skutkuje to jednak trudnościami w wyhodowaniu możliwych do implantacji przeszczepów, które nie zostaną odrzucone przez ludzki organizm. Te bowiem, aby mogły być w pełni funkcjonalne, muszą zostać unaczynione.
Kwestia unaczynienia stanowi zresztą główną przeszkodę, która powoduje, że inżynieria tkankowa nie rozwija się tak szybko, jak byśmy chcieli. Jesteśmy już w stanie biodrukować różne kształty tkanek i organów, ale cały czas to są tylko kształty na szalce. Clou problemu polega na uzyskaniu ich zdolności unaczynienia. A to już bardziej skomplikowany problem. W moim zespole chcemy uzyskać unaczynione konstrukty, w których składniki odżywcze będą docierać do całego biodrukowanego konstruktu. Dzięki temu pojawi się większa szansa, aby implant lub konstrukt tkankowy nie został odrzucony po wszczepieniu do organizmu – zapewnia dr Litowczenko-Cybulska.
Alternatywa dla przeszczepów
W swoich badaniach wykorzystuje komórki macierzyste. W barcelońskim IDIBELL prowadziła prace polegające na wytwarzaniu fibroblastów serca, komórek śródbłonkowych oraz mięśniowych z ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych pochodzących od dawców. Z tych zróżnicowanych komórek powstawały właśnie wspomniane wcześniej tubki. To nowatorskie podejście, dzięki któremu możliwe będzie opracowanie w niedalekiej przyszłości na przykład modelu aorty.
Hydrożelowe konstrukty tkankowe mogą stanowić w przyszłości alternatywę dla tradycyjnych przeszczepów, np. w chorobach sercowo-naczyniowych. Najskuteczniejszą metodą leczenia tych schorzeń pozostają na razie operacje z wykorzystaniem bypassów naczyniowych. Przeszczepy naczyniowe wykonane z materiałów syntetycznych mają bowiem poważne ograniczenia w postaci braku zdolności do przebudowy i wzrostu. Szczególnie w leczeniu dzieci zdolność do wzrostu wraz z pacjentem jest kluczowa. Jej brak może prowadzić do poważnych zwężeń lub zatorów, co skutkuje koniecznością wykonania kolejnych operacji. Za złoty standard uznaje się przeszczepy autologiczne, tyle że pozyskiwanie autologicznych naczyń jest często ograniczone ze względu na ich niską dostępność oraz warunki patofizjologiczne. Dodatkowo, w przypadku najmłodszych metoda ta jest skomplikowana i nie zawsze możliwa do zastosowania.
Inżynieria tkankowa oferuje obiecującą alternatywę na wytworzenie biologicznych przeszczepów naczyniowych wykonanych z biodegradowalnych hydrożeli zawierających komórki pacjenta, co w przyszłości pozwoli na naturalny wzrost i regenerację tkanek bez konieczności cyklicznych re-operacji u małych pacjentów – dodaje dr Jagoda Litowczenko-Cybulska, która do współpracy przy najnowszym projekcie zaangażowała naukowców z Hiszpanii, Finlandii, Stanów Zjednoczonych oraz partnerów gospodarczych.
Aneta Zawadzka