Tomograf holograficzny daje możliwość poznania w pełni trójwymiarowej charakterystyki mikroobiektów biologicznych.
Nowotwory to druga po chorobach układu krążenia najczęstsza przyczyna zgonów w Polsce. Definiuje się je jako zmiany spowodowane nadmiernym i niekontrolowanym rozrostem komórek. Jednym z podstawowych narzędzi do rozpoznania choroby nowotworowej jest badanie histopatologiczne, czyli ocena wycinka tkankowego pobranego od pacjenta. Od jej wyniku zależy dalsze rokowanie i wybór metody leczenia. Wycinek, zanim trafi pod mikroskop, musi być utrwalony, odwodniony, zatopiony w parafinie, pocięty na cienkie transparentne próbki, a na końcu odpowiednio zabarwiony. To sprawia, że badanie jest pracochłonne i wymaga dużo czasu, co dla czekającej na diagnozę osoby wiąże się z nadmiernym stresem. Nie musi tak być.
Wyobraźmy sobie mikroskop, pod którym można by monitorować „zdrowie” komórek biologicznych, a każda byłaby prześwietlana z wielu kierunków. Uzyskane dane, podobnie jak w tomografie komputerowym, pozwoliłyby zrekonstruować trójwymiarową geometrię struktur wewnętrznych komórki z dokładnością poniżej 200 nanometrów, ale również trójwymiarowy rozkład współczynnika załamania. Specjaliści mieliby więc wgląd do środka komórki, bez konieczności barwienia czy – jak w mikroskopie fluorescencyjnym – znakowania. Zresztą po co sobie wyobrażać, skoro prototyp takiego aparatu do badań materiału biologicznego na poziomie komórkowym już powstał. Zaprojektowali go naukowcy z Instytutu Mikromechaniki i Fotoniki Politechniki Warszawskiej.
Do tej pory mikroskop był narzędziem analizy jakościowej. Teraz jesteśmy na etapie przechodzenia z obrazowania do rzeczywistego pomiaru materii wewnątrzkomórkowej, jej rozkładu i zmian – tłumaczy prof. Małgorzata Kujawińska, która właśnie w inżynierii biomedycznej widzi naturalny kierunek rozszerzania zakresu zainteresowania i rozwoju współczesnej metrologii.
Wytycza go dziś bliska jej sercu holografia. Technologią tą fascynuje się już od czasu studiów, ale dopiero dwie dekady temu nastąpił prawdziwy zwrot w tym obszarze. Pomysły, które pozostawały dotąd w orbicie teoretycznych rozważań i nie zdołały wyjść poza laboratorium, jak choćby telewizja holograficzna, uzyskały nowy impuls do rozwoju. Pojawiła się holografia cyfrowa, polegająca z jednej strony na zastąpieniu rejestracji hologramów na kliszy fotograficznej zapisem cyfrowym obrazu, a z drugiej na ich rekonstrukcji cyfrowej.
Mimo że nadal istnieje technologiczna bariera co do rozdzielczości i wymiarów złożonych z milionów pikseli matryc, na których dokonuje się zapisu, to bezpośredni dostęp do cyfrowej rejestracji informacji optycznej zawartej w hologramach stworzył nowe możliwości pomiarowe szczególnie w technikach mikroskopowych. Równocześnie pojawienie się wysokorozdzielczych amplitudowych i fazowych modulatorów światła umożliwiło fizyczną rekonstrukcję cyfrowych hologramów oraz aktywną modyfikację rejestrowanych i rekonstruowanych frontów falowych, niosących informacje o obiekcie. Cyfrowe lub fizyczne łączenie stosunkowo niewielkich pól pomiarowych pozwoliło na rejestrację, wizualizację i pomiary dużych obiektów z zachowaniem wysokiej rozdzielczości przestrzenno-czasowej. Nastąpił wysyp nowych systemów bazujących na holografii cyfrowej, jak displeje holograficzne, kamery i interferometry holograficzne, mikroskopy i tomografy holograficzne. Badacze dostali nowe narzędzia pomiarowe, dzięki którym metrologia znacząco rozszerzyła pole działania.
Doszło do sprzężenia zwrotnego. Metrologia to bardzo praktyczna dziedzina, która odpowiada na aktualne zapotrzebowanie przemysłu i użytkownika w odniesieniu do konkretnych zadań pomiarowych. W przemyśle półprzewodnikowym jeszcze dwie dekady temu wymagana dokładność pomiarowa przy produkcji elektroniki scalonej była na poziomie stu nanometrów, teraz to już kilka nanometrów. Nie ma innego wyjścia, metrologia musi za tymi zmianami nadążyć – podkreśla prof. Kujawińska.
Holograficzne RTG
To właśnie cyfryzacja w największym stopniu doprowadziła do swoistego renesansu metrologii, której oblicze zaczęło się kształtować już pod koniec XVIII wieku wraz z wprowadzeniem systemu metrycznego. Dziś wykorzystuje się ją w wielu pomijanych dotąd obszarach, jak diagnostyka lekarska, farmakologia, sztuka i konserwacja dziedzictwa narodowego czy multimedia. Stała się jedną z technologii umożliwiających rozwój (tzw. enabling technologies).
W inżynierii biomedycznej też widać trend przejścia z jakościowej do ilościowej analizy badań. W tomografie holograficznym, nad którym prace moja rozmówczyni zaczęła w 2015 roku, chodziło o zastosowanie metod ilościowego obrazowania fazowego do „prześwietlenia” komórek i tkanek, a w przyszłości być może także większych struktur, jak choćby organelle. Urządzenie to daje bowiem możliwość poznania z wysoką rozdzielczością przestrzenno-czasową w pełni trójwymiarowej charakterystyki mikroobiektów biologicznych. Celem jest odpowiedź na pytanie, w którym momencie na poziomie komórkowym rozpoczyna się choroba. Za pomocą holografii specjaliści mogą monitorować całe hodowle komórkowe, wyszukiwać w nich obiekty, które zachowują się na podstawie określonych parametrów w sposób ilościowo różny, dokonywać selekcji. Do tej pory, z uwagi na rozmiar komórek i ich przezroczyste wnętrze, bez znacznikowania było to zadanie niezwykle trudne.
Chcemy dostarczyć lekarzowi dokładnej informacji ilościowej o zjawiskach zachodzących na poziomie komórkowym: zmianie kształtu, szybkości poruszania się, rozkładzie współczynnika załamania i suchej masy w komórce, jak również jej dwójłomności czy sztywności błony komórkowej. Jeden obiekt, a tak wiele można zmierzyć – przyznaje badaczka, której zespół opracował też system umożliwiający obrazowanie zmian w sposób dynamiczny, a więc np. pod wpływem podanej substancji chemicznej czy promieniowania.
Ale to nie wszystko. Dla weryfikacji metrologicznej wyników stworzono też cyfrowe i fizyczne modele i fantomy komórek 3D. Fantomy numeryczne umożliwiają badanie skomplikowanych algorytmów rekonstrukcji tomograficznej. Analogiczne trójwymiarowe fantomy fizyczne, drukowane metodą laserowej fotolitografii dwufotonowej, stanowią wzorzec umożliwiający wyznaczenie parametrów metrologicznych urządzenia, jego kalibrację, a wkrótce również przeprowadzenie badań porównawczych komercyjnych i badawczych tomografów holograficznych (i innych mikroskopów 3D). Mogą również wspomóc pomiary wykonywane z wykorzystaniem różnych metod. W przypadku hodowli komórkowych komplementarną informację uzyskuje się poprzez równoległe z cyfrową mikroskopią holograficzną użycie mikroskopii światła białego, fluorescencyjnej i polaryzacyjnej. Uspójnienie układu współrzędnych z pomocą fantomu umożliwia jednoznaczne przyporządkowanie każdemu punktowi badanej komórki zestawu mierzonych wielkości i efektywne wykorzystanie tej informacji w diagnostyce. Ta wielomodowość, zarówno w pomiarach nano, mikro, jak i makro, jest jednym z trendów współczesnej metrologii.
Inny to hierarchiczność pomiaru. W dużych obiektach, jeśli występuje w nich jakiś defekt i w konkretnym miejscu trzeba mierzyć z bardzo dużą dokładnością, nie wszystkie metody się sprawdzą. Wówczas w pierwszej kolejności stosuje się tę, która zawęzi obszar, np. optyczną. Później, już w mniejszym polu pomiaru, gdzie światło nie dochodzi, można użyć kolejnej, np. maszyny współrzędnościowej. Każda z nich ma swoje ograniczenia, ale mogą współgrać ze sobą przy dokonywaniu pomiaru w jednostkach różnej wielkości.
Na początku była linijka
Trzeba jednak pamiętać, że każdy fizyczny pomiar realizowany za pomocą konkretnego instrumentu ma ograniczenia. W optyce limitowana zdolność rozdzielcza nie pozwala wizualizować elementów mniejszych niż połowa długości fali światła. Cóż więc z tego, że kamery umożliwiają próbkowanie z bardzo dużą rozdzielczością, skoro układ optyczny tego nie wizualizuje, a więc i zmierzyć nie sposób. Żeby sobie z tym poradzić, stosuje się technologiczne tricki: jeżeli nie można czegoś zmierzyć mikroskopem optycznym, wykorzystuje się mikroskop sił atomowych albo mikroskop elektronowy. W tym ostatnim długość fali jest znacznie krótsza, wobec tego i zdolności pomiarowe przesuwają się w kierunku większych dokładności. Badaczka z Politechniki Warszawskiej zwraca uwagę na jeszcze jedną ważną kwestię: niepewność pomiarowa jest immanentną cechą metrologii. Nawet przy metodzie dobrze już znanej warunki zewnętrzne lub sposób realizacji pomiaru mogą bowiem zniekształcić pomiar.
Przesunęliśmy się w rozwoju metrologii od metaforycznej linijki do bardzo wysublimowanych metod, nawet takich, które nie dają pomiaru bezpośredniego. Dopiero w połączeniu z wiedzą co do charakteru zjawiska fizycznego, które powstaje np. przy interakcji między materiałem a promieniowaniem elektromagnetycznym, można poprzez zastosowanie odpowiedniego modelu matematycznego przybliżyć się do wyznaczenia wartości wielkości zakodowanej w pomiarze – tłumaczy prof. Kujawińska, która od lat bierze udział w pracach nad standaryzacją ścieżek pomiarowych i wyznaczaniu niepewności pomiarów realizowanych metodami optycznymi w całym polu widzenia w obiektach biologicznych, inżynierskich i dziedzictwa kulturowego.
Bo choć metrologia zaczęła być wykorzystywana w całkiem nowych obszarach, to dotychczasowe też zyskują na jej rozwoju. Na Politechnice Warszawskiej właśnie pracują nad metodą pomiarów łopat turbin wiatrowych. Elementy te sięgają ponad 100 metrów długości, a ich odchylenia w wyniku działania sił mogą dochodzić nawet do kilkudziesięciu centymetrów. Istotne jest, by uszkodzenie materiału, z którego są wykonane, dostrzec już wtedy, gdy jest ono rzędu mikrometrów. W tak dużym polu widzenia monitoring z wymaganą rozdzielczością pomiarową oprócz problemów aparaturowych wiąże się z przetwarzaniem ogromnej ilości danych.
Podobnie jest nie tylko przy pomiarach dużych obiektów inżynierskich, gdzie punktów pomiarowych są dziesiątki lub setki milionów, ale również w zastosowaniach biomedycznych, np. w badaniu typowego preparatu histopatologicznego (15 mm × 10 mm) czy długoterminowym monitoringu hodowli komórkowej. Pomiar w 3D oznacza terabajty danych, które trzeba przetworzyć i wydobyć te najbardziej potrzebne. Do tych zadań coraz częściej zaprzęgana jest sztuczna inteligencja. Również po to, by w diagnostyce móc korzystać z banków danych biologicznych, które przy deficycie lekarzy histopatologów ułatwią analizę wyników badań. Na razie brak wiarygodnego punktu odniesienia jest największą bolączką metrologii. Nie ma ujednoliconych procedur, standardów, wzorców kalibracyjnych. Porównanie wyników uzyskanych w dwóch różnych laboratoriach nierzadko bywa karkołomne. Na całym świecie trwają więc badania nad opracowaniem sposobów weryfikacji zmierzonych wartości, jak i normalizacją samych urządzeń.
To niejedyne wyzwanie stojące przed metrologami. Chcą także szerzej wyjść z pomiarami poza laboratorium. W stabilnych warunkach pomiar zazwyczaj nie nastręcza problemów, w rzeczywistym środowisku jest już trudniej. Wszystko przez zewnętrzne czynniki, które potrafią zniekształcić wynik. W astronomii to się jednak udało poprzez wprowadzenie do dużych teleskopów aktywnych systemów, które usuwają zaburzenia wynikające z turbulencji powietrza. To samo próbuje się zrobić w metrologii. Jeszcze innym pomysłem, który w przyszłości ma szansę zrewolucjonizować tę dziedzinę, jest „personifikacja” pomiaru, czyli dostosowanie systemu pomiarowego do konkretnego obiektu.
Mariusz Karwowski
Artykuł ukazał się w numerze 11/2022 FA